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马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因的克隆与功能研究

宋波涛  
【摘要】:马铃薯是我国乃至世界的第四大粮食作物,用途广泛,其加工产品薯片和薯条是风靡全球的食品。为了抑制常温贮藏产生的块茎失水皱缩、病害传播、发芽等问题及延长加工周期,常将马铃薯块茎贮藏在低温条件下。但低温导致块茎中还原糖积累,在高温油炸时发生褐化反应,降低了油炸薯片和薯条的品质,甚至对人体健康产生不良影响。因此,控制“低温糖化”已经成为马铃薯采后生理学研究的热点。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是植物淀粉.糖代谢过程中的一个限速酶,催化还原糖向淀粉方向转化。马铃薯AGPase为异源四聚体,由2个小亚基和2个大亚基组成,AGPase大亚基只起调节作用,而活性则由小亚基控制。前人研究表明,马铃薯淀粉合成曲线与AGPase的积累曲线基本一致,抑制AGPase的活性将导致淀粉合成的部分或全部终止,但AGPase活性与马铃薯块茎还原糖含量间的关系还不十分明确,特别是AGPase活性与马铃薯“低温糖化”间的关系还未见报道。因此,进一步阐明AGPase活性与马铃薯块茎淀粉和还原糖含量间的关系,对于马铃薯淀粉-糖代谢调控具有重要的理论和实践意义。 本研究旨在克隆腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因(sAGP),分别构建由组成型启动子CaMV 35S和块茎特异启动子CIPP驱动的正、反义sAGP基因载体以及sAGP干涉载体,通过转化马铃薯,研究sAGP的表达与马铃薯块茎淀粉和还原糖含量间的关系,并揭示sAGP在马铃薯块茎抗“低温糖化”方面的功能。主要结果如下: 1.以sAGP的保守位点设计1对引物,用RT-PCR结合RACE的方法,从低温处理的马铃薯品系JH块茎cDNA中,扩增出一条约1.9kb的特异性条带,DNA序列测定表明,目标片段为sAGP,全长1854bp,包含一个1563bp的开放阅读框架,编码521个氨基酸。5′端有63bp的非翻译区,3′端包含219bp的非编码序列,3′端poly(A)尾端上游12bp和19bp处有加尾信号AATAAA。该基因已在GenBank注册,登记号为AY186620。将该基因PCR必要的改造后,克隆到酵母表达载体pMETα-B中,构成表达载体pMETαA4,再将其线性化,用电穿孔法导入Pichia methabolicapMAD16。筛选的重组表达酵母经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE电泳可以检测到50kD左右的特异蛋白带。酶活性测定表明,诱导表达重组酵母的AGPase活性明显上升,证明所克隆的sAGP基因是一个完整的功能基因,其表达产物能提高AGPase活性。 2.为了研究sAGP在调控马铃薯块茎淀粉-糖代谢方面的功能,本研究分别构建了组成型启动子CaMV 35S和马铃薯块茎特异启动子CIPP驱动的正、反义sAGP基因转化载体及RNAi干涉载体,通过转化马铃薯主栽品种“鄂马铃薯3号”和“南中552”,获得各类转基因株系140多个。对其中93个株系的酶活性、还原糖等相关指标分析结果表明,增强sAGP基因的表达,AGPase酶活性提高,淀粉含量上升,还原糖含量下降。在CaMV 35S驱动的转正义sAGP基因株系中,共测定了23个株


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