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《华中农业大学》 2006年
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应用RNA干扰技术抑制口蹄疫病毒的基因表达与复制的研究

胡勤芹  
【摘要】:口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)引起的多种偶蹄动物共患的急性传染病,被国际兽疫局(OIE)列为A类传染病之首。 FMDV基因组只有一个开放的读码框,首先翻译为一个多聚蛋白,经过蛋白酶切割为成熟的结构和非结构蛋白。其中3C基因编码一个巯基蛋白酶,它将FMDV的P12A前体切割成VP4,VP2,VP3和VP1四种结构蛋白,包装成病毒的衣壳。因此3C在FMDV复制中具有非常重要的作用。RNA干扰(RNAi)现象是由与靶基因序列同源的dsRNA引发的广泛存在于动植物中的序列特异性基因转录后的沉默过程。研究发现,小于30nt的siRNA分子可以诱导产生明显的RNA干扰现象,抑制甚至关闭相应靶基因的表达,被广泛用于基因功能、遗传病和感染性疾病的治疗研究,取得了诱人的结果。FMDV的3C基因在FMDV不同血清型和亚型中非常保守,本研究针对3C基因开展了siRNA的研究,筛选到可以有效抑制FMDV复制的siRNA分子,现报告如下。 首先,本研究克隆了FMDV O型的3C和3D基因,在大肠杆菌中进行了高效表达,并用纯化的表达产物免疫家兔,制备了的多克隆抗体,为3C和3D基因表达与功能研究提供了有用工具。 我们详细比较了O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1七个血清型FMDV的3C基因序列,根据其高度保守区的序列和美国Ambion公司建议的siRNA设计原则,设计并合成了2个siRNA模板3C07和3C12,分别克隆到siRNA表达载体pSilencer 4.1-CMV neo的CMV启动子下游,构建相应的重组表达质粒pSilencer-3C07和pSilencer-3C12。同时,从FMDV O型感染性克隆中通过PCR扩增了3C基因,将3C基因克隆到真核表达载体pEGFP-N3中,按照读码框架与EGFP基因的5'端融合,获得重组表达质粒p3C-EGFP。将pSilencer-3C07、pSilencer-3C12和阴性对照质粒pSilencer-NC分别与p3C-EGFP共转染BHK-21细胞,荧光显微镜观察和流式细胞仪分析结果表明,3C07和3C12均能不同程度地抑制3C基因的表达,抑制效率分别为30.9%和60.5%,可见3C12比3C07对3C基因表达的抑制效率高。 进一步将pSilencer-3C07、pSilencer-3C12和pSilencer-NC分别转染BHK-21细胞,24h后接种FMDV,接种46h后病毒滴度下降了10-100倍,半定量RT-PCR和
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q789;S852.65

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