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《华中农业大学》 2006年
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枳实加工副产物中柠檬苦素类似物的分离、分析及活性研究

刘亮  
【摘要】: 枳实为芸香科植物酸橙及其栽培变种或甜橙的干燥幼果及未成熟果实。目前对其有效成分的研究主要集中在生物碱、黄酮和挥发油等方面,而对枳实中柠檬苦素类似物的研究鲜有报道。近年来,柠檬苦素类似物一直是国外研究的热点,大量研究表明柑桔及其副产物富含柠檬苦素类似物,并且该类物质具有抗癌、昆虫拒食和抗氧化等活性。枳实作为柑桔的一种,含有一定量的柠檬苦素。因此,本文以枳实加工副产物为原料,对其中柠檬苦素类似物的提取、分离纯化、分析鉴定、抗氧化及抗菌活性进行了系列研究,主要研究结果如下: 1柠檬苦素类似物甙元的分析 建立了柠檬苦素的高效液相色谱分析方法。色谱条件为:色谱柱:PhenomenexC_(18)柱(250×4.6mm,5μm);流动相:乙腈/水=45/55(v/v);流速:1mL/mim;柱温:25℃;检测波长:210nm。经考察该方法对柠檬苦素和诺米林均有良好的线性关系,相关系数分别为0.9986和0.9992,加标回收率分别99.82%~102.99%和92.80%~100.63%,精密度分别为2.55%和2.30%,且该方法简便、快速,可用于柑桔及其副产物中柠檬苦素和诺米林的定量分析。 用建立的高效液相色谱分析方法对枳实加工副产物和不同柑桔品种中的柠檬苦素和诺米林的含量进行了分析,结果表明:柠檬苦素和诺米林两种主要甙元的含量因柑桔品种、组织及成熟度而异。枳实加工副产物中柠檬苦素的含量高于其它柑桔品种。就不同柑桔品种而言,柑桔种子和外皮中甙元的含量要高于内皮、瓣膜中的含量,果肉中含量最低。半成熟品种中两种甙元的含量高于成熟品种。外皮中,诺米林的含量高于柠檬苦素的含量,而种子中柠檬苦素的含量要高于诺米林。 2柠檬苦素提取条件的研究 通过单因素实验和旋转正交实验确定了枳实加工副产物中柠檬苦素的最佳提取条件为:6倍于原料的78%乙醇(pH 6.5)于60℃下回流提取1次,提取时间为2h。且该方法成本低,无毒性溶剂残留,有利于工业化生产。 3柠檬苦素类似物的分离纯化 用大孔树脂和葡聚糖凝胶柱层析分离纯化柠檬苦素类似物。大孔树脂的最佳柱分离条件为:将上样液的pH调为7.5,上柱,依次用pH7.5的水、50%乙醇、70%乙醇进行洗脱,收集70%乙醇洗脱液,经浓缩,冷冻干燥可得柠檬苦素类似物粗提物(FAC)。该工艺制备产品的得率为3.21%,柠檬苦素的含量为4.55%。 将大孔树脂分离得到的粗提物FAC用少量乙醇溶解后用Sephadex LH-20凝胶柱进一步纯化,其最佳分离条件:将上样后的样品依次用50%乙醇、70%乙醇进行洗脱,每梯度收集40管,流速为0.5mL/min,12min/管。各管用Ehrich's试剂显色后在400nm处比色,根据吸光值的大小绘制色谱图,共得到五个色谱峰,分别收集各峰,浓缩、冷冻干燥可得五级分(分别为FA1、FA2、FA3、FA4、FA5)。经高效液相色谱分析和紫外光谱初步鉴定表明,只有FA4中含有柠檬苦素,其含量为9.96%。 4柠檬苦素类似物糖甙的分析及鉴定 根据文献报道,建立了柠檬苦素类似物糖甙的高效液相色谱分析方法。色谱条件为:色谱柱:Phenomenex C_(18)柱(250×4.6mm,5μm);流动相:乙腈(A)-3mM磷酸(B)二元梯度洗脱,15%A(Omin)~26%A(40min);检测波长:210nm;流速:1mL/min;柱温:25℃。高效液相色谱及紫外光谱分析表明:FA2、FA3、FA4、FA5中不含柠檬苦素类似物糖甙,FA1中可能存在糖甙成分,其HPLC-ESI/MS/MS的分析结果表明:FA1中存在的糖甙成分可能为诺米林酸甙。 5不同枳实提取物的生物活性 通过体外实验研究了不同提取物清除羟基自由基的能力和抑菌活性。清除羟基自由基的实验结果表明:FA1~FA4在400μg/mL~2000μg/mL对·OH自由基有不同程度的清除作用,以FA3的清除效果最好。在200μg/mL时,柠檬苦素和诺米林的抗氧化活性高于FA1和FA4,而低于FA3。这可能与FA3中含有大量黄酮类物质和FA1、FA4所含柠檬苦素类似物有关。抑菌实验结果表明:各级分对细菌都有不同程度的抑制作用,而对霉菌和酵母菌几乎无抑制作用。其中FA1和FA3对细菌的抑制效果较好,FA4次之。温度和pH值对抑菌活性有较大影响,低温处理和微酸性条件有利于抑菌活性的发挥。但各级分中的有效成分还有待于进一步的深入研究。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:TS201

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