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玉米profilin3基因的克隆表达分析及其启动子的分离

邵培  
【摘要】: Profilin(前纤维蛋白)是一种12-15kD的小分子量的单体肌动蛋白结合蛋白,存在于所有的真核细胞中。Profilin基因家族通过在不同条件下引起肌动蛋白纤维的聚合和解聚来调节细胞中肌动蛋白骨架的形成。研究揭示,该基因可能在花粉萌发及花粉管伸长时期对肌动蛋白重新组合的信号转导和调控起重要作用。最近有研究表明,profilin还在RNA转录以及前体mRNA的剪接调控中起作用,具有广泛的生理意义。 本文依据本室Zhang等人在玉米S-Mol7~(Rf3Rf3) cDNA芯片杂交的研究中,检测到在花粉发育后期profilin3基因上调表达的结果,结合RACE等技术,开展玉米profilin3基因的克隆表达及其启动子的分离等相关研究,获得以下结果: 1、采用RACE技术,从玉米S-Mol7~(Rf3Rf3)花粉中克隆得到profilin3基因的全长cDNA,命名为ZmPRO3,并在GenBank登记注册(EF546785)。测序结果表明该cDNA全长864bp,包含一个396bp的完整的ORF(开放阅读框),编码131个氨基酸。ZmPRO3蛋白具有潜在的profilin蛋白保守域,并与多个物种的profilin蛋白序列具有很高的同源性。此外,本研究还对ZmPRO3蛋白的性质及结构进行了部分预测。 2、分别扩增玉米近等基因系S-Mol7~(rf3rf3)和S-Mol7~(Rf3Rf3)完整的ORF及相应的基因组DNA,得到仅在S-Mol7~(Rf3Rf3)共396bp的ORF,及近等基因系两者中长度依次为585bp和570bp的基因组片段。运用GENSCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)网站分别预测两者的基因结构,结果发现,其基因组DNA中均包含三个外显子和两个内含子,不过两者相应的内含子长度及第二个内含子的剪接位点有所不同。利用Clustal W工具将S-Mol7~(rf3rf3)和S-Mol7~(Rf3Rf3)的基因组序列进行比对,结果共检测到48个(8.2%)变异位点,其中有23个(3.9%)位点为缺失变异,其它25个(4.3%)位点则都是点突变。目前,针对两者DNA水平的差异分析正在进行中。 3、利用Northern杂交技术,在玉米近等基因系S-Mol7~(rf3rf3)和S-Mol7~(Rf3Rf3)的不同组织器官中,对ZmPRO3基因的表达情况进行研究。结果表明,该基因在两者花粉之外的其它组织中均不表达,但在两者花粉中的表达存在很明显的差异。即ZmPRO3基因在S-Mol7~(rf3rf3)花粉中检测不到杂交信号,而在S-Mol7~(Rf3Rf3)花粉中则信号较强,表明该基因的表达具有明显的花粉特异性。这与Zhang等人芯片杂交结果相一致。经过分析,ZmPRO3基因在花粉间的表达差异,说明该基因可能参与了正常花粉的发育过程。 4、采用染色体步移技术,分离得到ZmPRO3基因在玉米近等基因系S-Mol7~(rf3rf3)和S-Mol7~(Rf3Rf3)中的部分启动子区。测序结果显示该区域共604bp,且在两者中此段序列是完全一致的。在GenBank数据库中对该序列进行同源性比对,结果显示该段启动子序列为首次克隆得到。将其于GenBank中登记注册,编号为EF565370。经分析,所获序列中含有4个TATA box、5个CAAT框、7个GC框、多处在启动基因花粉特异性表达中起重要作用的顺式元件,以及多种与胁迫相关的顺式元件。因此,我们推测该启动子对ZmPRO3基因表达的调控很可能具有花粉特异性,并且ZmPRO3基因可能会对多种生物和非生物胁迫产生响应,但这都需要进一步的实验去证明。


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