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Bt毒蛋白cryIAb/Ac基因在毕赤酵母GS115中的表达研究

胡南  
【摘要】: 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是农业生产中运用得非常广泛的一种重要的杀虫微生物。由于在使用过程中存在一些不足和害虫抗药性的产生,人们通过生物技术的手段将Bt毒蛋白基因转入其它植物或微生物中,扩展了Bt的杀虫谱并降低害虫对其的抗性。本研究将Bt毒蛋白基因CryIAb/Ac克隆到毕赤酵母GS115中,构建带有cryIAb/Ac基因的工程菌。 运用primer5软件设计带有限制性内切酶NotⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物,通过PCR的方法扩增cryIAb/Ac基因带编码毒蛋白3个结构域的1.8kb序列,并对这两条基因片段进行了亚克隆,构建出载体pMD-cryIAb/Ac。将建载体pMD-cryIAb/Ac进行序列测定,其中cryIAb基因有2个碱基发生改变,编码一个氨基酸发生改变,但不编码毒蛋白的活性中心;cryIAc基因与原基因序列相同。选择毕赤酵母表达载体pPIC9K,利用限制性内切酶NotⅠ和EcoRⅠ双酶切pMD-cryIAb/Ac和表达载体pPIC9K,再通过T4连接酶连接,构建出分泌型重组载体pPIC9K-CryIAb/Ac。用电转化方法转化到毕赤酵母GS115,筛选出阳性转化子。PCR鉴定证明cryIAb/Ac基因已成功转入毕赤酵母GS115中。 在甲醇的诱导下,CryIAb/Ac毒蛋白都得到了有效分泌和表达。通过SDS-PAGE凝胶电泳分析,cryIAb/Ac基因表达的重组蛋白都在70kDa左右。当诱导pH值为6.6时,摇瓶诱导发酵72小时的蛋白表达量都达到最大。生物测定结果表明,CryIAb/Ac毒蛋白对甜菜夜蛾和二化螟都有较强的毒杀作用。CryIAc毒蛋白对甜菜夜蛾的LC_(50)为0.28μg/ml,CryIAb毒蛋白对甜菜夜蛾的LD_(50)为0.76μg/ml,CryIAb毒蛋白对二化螟的LC_(50)为0.40μg/ml,CryIAc毒蛋白对二化螟的LC_(50)为0.28μg/ml。


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