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《华中农业大学》 2007年
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油菜防御反应基因诱导表达和候选抗菌核病基因的转化研究

付浩  
【摘要】: 由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary)引起的菌核病是油菜的主要病害之一。利用抗病品种是该病害防治的经济有效措施。然而目前高抗材料缺乏,抗病分子机制尚不清楚,需要发展或采用新技术寻找关键的抗病基因,进行抗病育种。近年来植物功能基因组学和基因工程的研究进展迅速,特别是在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中抗病性功能基因与抗病分子机制研究取得了突破性进展。在油菜中嫁接和发展这些技术,克隆和研究油菜抗病性功能基因,以提高油菜对菌核病的抗性具有重要的理论和实践意义。 本研究分为两个部分。首先探讨了化学信号分子对油菜的诱导抗病性,了解油菜中是否存在拟南芥的病害防御反应机制。以此研究为依据,选择克隆油菜抗病相关基因,进行转基因表达研究,以明确这些基因的功能与抗病育种利用价值。 在诱导抗性研究中,所利用的化学物质有病害防御反应信号传导分子甲基茉莉酸(MeJA)和苯丙噻重氮(BTH,水杨酸类似物),以及菌核病毒素草酸(OA)。诱导处理油菜叶片后检测病害防御反应信号传导途径中标记基因的时序表达情况,基因包括PBF1.2(茉莉酸途径中的标记基因)、PR-1(水杨酸途径中的标记基因)、NPR1(上述途径调控基因)、APX(与氧爆发途径相关的基因)以及PR-5、GZU和CHI等几个病程相关蛋白基因。研究表明,化学处理能诱导这些基因不同程度的上调表达。由此推导油菜抗病反应中可能存在这三种重要的病害防御反应信号传导途径。 在转基因功能研究中,首先对由上述化学物质诱导表达的基因,即本课题组测序获得的UniGene库,进行生物信息学分析,选择出可能在主要抗病信号途径中起作用的基因,然后分别构建过表达和RNAi载体,进行油菜转化。生物信息学分析后选择出三个全长基因,分别命名为BNT19K4、BNFTA10、BNF5011。以中间载体pG4A为基础,构建了三个植物过表达载体pGTK、pGFA和pGF0,以pG4A-intron为基础构建了两个RNAi植物表达载体pGRTK和pGRFO。这些载体均包含抗除草剂草胺膦基因bar。采用类似花粉管通道法分别对甘蓝型油菜和白菜型油菜进行遗传转化。在甘蓝型油菜转化中,共获得13002粒过表达载体转化的种子和17401粒RNAi转化的种子。对转基因T0代植株进行除草剂筛选,获得过表达植株305株(RNAi的种子尚未来得及筛选)。经PCR鉴定,其中80%的植株为阳性。在植物过表达载体pGTK、pGFO和RNAi植物表达载体pGRTK、pGRFO转化白菜型油菜中,抗除草剂的TO代转基因油菜苗共94株,经过PCR分子生物学鉴定,其中80%的植株为阳性。 本研究采用离体叶接种法分别对植物过表达载体pGTK、pGFA、pGFO的转基因甘蓝型油菜T0代株系中PCR阳性的植株进行菌核病抗性鉴定。分析表明,转基因油菜和非转基因油菜抗病性差异明显。转基因油菜上菌丝侵染迟,扩展慢,病斑平均直径明显小于非转基因油菜,即对菌核病的抗性明显提高。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S435.654

【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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【同被引文献】
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