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《华中农业大学》 2007年
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陆地棉纤维特异表达基因的克隆与表达研究

刘迪秋  
【摘要】: 棉花是世界上的重要经济作物,棉纤维是纺织工业中天然纤维的主要来源。除了具有重要的经济价值,棉纤维还是研究植物细胞伸长和细胞壁建成以及纤维素生物合成的优良模型。棉纤维由棉花胚珠外珠被表皮层的单细胞发育而成,属于种子表皮毛,其分化和发育过程由四个相互重叠的时期组成。在棉纤维的发育过程中,有大量基因在其中活跃表达。克隆这些与棉纤维发育有关的基因,并精确阐释其功能,不仅可以深入认识棉纤维伸长和纤维素生物合成的分子机理,还可以为改良棉纤维品质的遗传工程奠定物质基础。 棉花纤维在10DPA左右处于快速伸长期,而在20DPA经历从伸长到次生壁加厚的发育阶段转换。为了分离棉纤维特异表达基因,我们以陆地棉遗传标准系‘TM-1’为材料,构建了两个纤维细胞的抑制差减杂交(SSH)cDNA文库。来自于10DPA和20DPA的纤维cDNA分别作为两个SSH文库的Tester,来自五个非纤维组织根、下胚轴、叶、花瓣、胚珠的混合cDNA作为两个文库的共同Driver。反向Northern杂交在两个文库中共筛选到292个克隆,它们在纤维细胞中的表达显著强于在非纤维组织中的表达。序列分析共产生66条单一序列,一些已经报道的棉纤维特异表达基因包括在内。另外还有一些基因,如苹果酸脱氢酶基因、可能的赤霉素调节基因、几个新的编码阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan proteins,AGPs)的基因、生长素响应蛋白基因等,它们在纤维发育过程中优势表达还是首次发现。Northern杂交分析显示从文库中筛选的基因都是纤维特异或优势表达基因。那些来自10DPA纤维文库中的基因在纤维发育前期优势表达,而从20DPA纤维SSH文库中分离到的基因则在15DPA之后大量表达。另外,我们还分析了一些陆地棉纤维特异或优势表达基因在海岛棉、亚洲棉纤维发育过程中的表达差异。总的来说,这些陆地棉纤维优势表达基因在海岛棉、亚洲棉的纤维发育过程中表达也很强。与其它三个基因型(‘TM-1’,‘Pima 3-79’,亚洲棉‘如东鸡角桠果’)相比,大部分基因在亚洲棉‘美国中棉971’纤维中的表达相对较弱,暗示与纤维发育相关的基因在‘美国中棉971’纤维细胞中的表达不足可能导致其纤维的缺陷表型(分化的纤维数少,并且没有短绒)。这些棉纤维特异或优势表达基因的发现丰富了对棉纤维发育机理的认识。 通过5’RACE我们对10DPA纤维SSH文库中两个编码水通道蛋白(aquaporins,AQPs)的cDNA序列进行了全长基因克隆,分离的两个基因分别命名为GhPIP1-2、GhγTIP1。GhPIP1-2全长cDNA 995bp,包含861bp的开放读码框(ORF),编码一个含287个氨基酸的蛋白质,预测分子量为30.9KDa,等电点8.6。GhγTIP1全长cDNA为923bp,包含756bp的ORF,编码一个含252个氨基酸的蛋白质,分子量25.8KDa,等电点4.80。同源性分析显示GhPIP1-2、GhγTIP1编码的蛋白质分别与陆地棉GhAQP1(ABD639041)和大豆(Glycine max)nodulin-26(AAA02947)的同源性最高。对GhPIP1-2、GhγTIP1编码的蛋白序列进行生物信息学分析,发现它们都具有AQPs的典型特征:小的疏水蛋白,具有5个环(A~E)相连的6个跨膜a螺旋,其中环B和环E以相反的方向各自形成一个短小的a螺旋状结构域。两个a螺旋结构域各自包含一个高度保守的由三个氨基酸(Asn-Pro-Ala)组成的NPA模体。几类植物AQPs的聚类分析显示GhPIP1-2编码蛋白属于PIP亚家族的PIP1类,GhγTIP1编码蛋白属于TIP亚家族的γTIP类。基因结构分析发现GhPIP1-2、GhγTIP1分别具有三个和两个内含子。Southern杂交结果表明GhPIP1-2、GhγTIP1在陆地棉和海岛棉基因组中属低拷贝基因,且具有多个同源基因。Northern杂交以及Real-time PCR分析表明GhPIP1-2和GhγTIP1都在棉纤维伸长期特异表达。它们在陆地棉和海岛棉中的表达模式很相似,只是在海岛棉中的表达水平相对较低。推测GhPIP1-2、GhγTIP1可能以介导大量水分快速进入液泡的方式在纤维伸长过程中起重要作用。 我们还对20DPA纤维SSH文库中四个编码AGPs的cDNA片段进行了全长基因的克隆,获得的四个基因分别命名为GhAGP2、GhAGP3、GhAGP4、GhFLA1。GhAGP2全长cDNA为886bp,包含729bp的完整ORF,编码一个具有243个氨基酸的蛋白质,分子量为25.6KDa,等电点9.27。GhAGP3全长cDNA为915bp,具有长度为792bp的ORF,编码含有264个氨基酸的蛋白质,分子量为27.8KDa,等电点为6.82。GhAGP4全长cDNA为1090bp,包含长717bp的ORF,编码一个含239个氨基酸的蛋白质,分子量25.4KDa,等电点8.67。GhFLA1的全长cDNA为961bp,包含一个732bp的ORF,编码蛋白质由244个氨基酸组成,分子量为25.8KDa,等电点为7.7。同源性分析显示GhAGP2、GhAGP3、GhAGP4编码的蛋白序列都与陆地棉GhAGP1(AA092753)高度同源;GhFLA1编码的蛋白则与拟南芥未知蛋白(AAN60339)、拟南芥FLA9(fasciclin-like arabinogalactan protein 9)(NP_563692)、FLA6(NP_565475)高度同源。对四个基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析,发现它们都包含N端信号肽序列,具有富含Ala、Ser、Thr、Pro/Hyp的长度可变区以及C端疏水跨膜区,还具有两个富含非连续Pro(P)的AGP-like domain,C端存在可能的GPI锚定区。另外四个基因编码的蛋白序列都包含一个保守的FAS1结构域。说明GhAGP2、GhAGP3、GhAGP4、GhFLA1编码的蛋白都是fasciclin-like AGPs(FLAs)。基因结构分析显示这四个AGPs基因都没有内含子。Southern杂交结果表明它们在陆地棉以及海岛棉基因组中属低拷贝基因,并且具有多个同源基因。Northern杂交以及Real-time PCR表明四个AGPs基因均是纤维特异表达基因,GhAGP2、GhFLA1主要在5DPA-20DPA期间表达,GhAGP3、GhAGP4集中在15DPA~25DPA期间表达。它们在海岛棉和陆地棉中的表达模式有较大的差异,尤其是GhAGP3和GhAGP4。GhFLA1在海岛棉和陆地棉中的表达水平差异较大,其在海岛棉中的表达大大强于在陆地棉中的表达。生物信息学以及表达类型分析暗示GhFLA1、GhAGP2可能参与棉纤维细胞的快速伸长和初生壁发育,而GhAGP3、GhAGP4可能更多参与次生壁的沉积过程。 为了获得纤维特异表达启动子,用于改良纤维品质、提高产量以及赋予纤维新特性的基因工程中,我们进一步分离了四个纤维特异表达基因的启动子,即pGhPIP1-2、pGhγTIP1、pGhAGP4、pGhFLA1。四个启动子的长度分别约为840bp、400bp、1210bp、1400bp。用PlantCARE软件分别对四个启动子的顺式作用元件进行预测,发现每个启动子中都具有很多真核生物顺式元件的同源序列,如与光调控有关的元件、与激素反应相关的元件、与胁迫反应相关的元件。 此外,我们还利用RNAi来研究纤维特异表达基因在棉纤维发育过程中的准确功能。共获得了三个陆地棉纤维特异表达基因GhPIP1-2、GhγTIP1、GhAGP4的RNAi遗传转化再生植株。PCR检测结果表明RNAi转基因植株的阳性率高达91%。至于RNAi转化再生植株中基因的表达是否受到抑制以及抑制的效果如何,会陆续进行相关研究分析。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S562

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