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《华中农业大学》 2007年
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钙调素(CaM)和Aux/IAA基因克隆及其在梨、柑橘子房/幼果和体细胞胚胎发生中的表达研究

岳海林  
【摘要】: 钙是决定果实品质形成的重要矿质元素,本研究通过对钙吸收和钙离子信号转导相关基因——钙调素(CaM)和Aux/IAA进行克隆及其在子房(幼果)和体细胞胚胎发生中的表达研究,探讨其在果实钙吸收和体细胞胚胎发生中的作用机理。主要研究结果如下: 1、CaM和Aux/IAA的克隆及序列分析 (1)以温州蜜柑国庆4号(Citrus unshiu Marc.cv.Guoqing 4)基因组DNA和盛花前后子房和幼果的总cDNA为模板进行特异性扩增,分别得到CaM基因的两条DNA和4条cDNA片段以及一条Aux/IAA的全长cDNA。CaM基因的碱基序列和氨基酸序列之间高度保守,在柑橘基因组上均有1-2个拷贝,推测可能是两种不同的钙调蛋白亚型或一个基因的两个不同拷贝,命名为CuCaM。Aux/IAA的全长cDNA在柑橘基因组中为单拷贝,命名为CuAux (2)从红肉脐橙(C.sinensis Osbeck‘Cara Cara’)果肉cDNA文库中,筛选得到了一条Aux/IAA基因的全长cDNA,命名为CsAux。Southern杂交表明:CsAux在柑橘基因组中为多拷贝基因,在柑橘上较为保守。 2、钙调素(CuCaM)和CsAux在子房(幼果)和体细胞胚胎发生过程中的表达研究 (1) CuCaM在黄花梨(Pyrus pyrifolia NaKai cv.Huanghua)盛花前后子房和幼果中的表达研究。Northern杂交和mRNA原位杂交结果表明,钙调素基因在黄花梨子房和幼果中的表达水平,花前较高,至盛花时最高,花后又下降;钙调素mRNA在梨果中的表达多集中于果皮、果肉、胚珠和果肉微管组织,而在果心的表达较少,且表达水平为果皮>果肉>果心,珠心>胚囊>珠被。在细胞水平上,CuCaM的表达主要集中于细胞的胞间隙和胞间层及细胞核。钙调素在盛花期子房/幼果中的大量表达,可能与果实钙的增加有一定关系。 (2) CuCaM和CsAux在柑橘盛花前后子房和幼果中的表达研究。结果表明:CuCaM和CsAux在国庆4号盛花前和盛花期子房中均有较高表达,花后趋向下降;而CuCaM和CsAux在华农本地早橘子房和幼果中的表达盛花前后一直保持上升趋势。华农本地早橘花后受精不良的幼果及胚珠中CuCaM和CsAux表达水平明显低于同期正常发育的幼果。CuCaM和CsAux在胚囊中的表达,盛花前呈上升趋势,直到花后3天。CuCaM和CsAux在胚珠中的表达存在极性分布,在合点端的表达高于珠孔端。CuCaM和CsAux在两品种子房和幼果中的分布基本一致,主要分布在外果皮、胚珠等分裂旺盛的部位。细胞水平上,CuCaM主要分布于细胞壁、胞间层及胞间隙。由此表明,受精作用促进了CuCaM和CsAux的表达,钙调素和CsAux可能参与调控细胞分裂和胚胎发生。 3、CuCaM和CsAux在体细胞胚胎发生中的表达研究 (1) CuCaM在默科特橘橙(C.reticulata×C.sinensis)体细胞胚胎发生中的表达和CsAux在纽荷尔脐橙(C.sinensis Osbeck cv.‘Newhall’)体细胞胚胎发生中的表达基本一致。CuCaM和CsAux在胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织中均有表达,在胚性愈伤组织中的表达水平远高于非胚性愈伤组织;随着体细胞胚的发育,在多细胞原胚、初生小球胚和球形胚中的表达水平高于胚性愈伤组织,在心形胚、鱼雷胚和子叶胚中的表达水平相当,但低于球形胚时期;在已分化的胚状体中,在原表皮和原形成层等细胞分裂旺盛的部位表达水平明显较高。CuCaM和CsAux在胚状体中的表达存在极性分布,倾向于集中在胚芽端大量表达,在胚根中的表达也较高。细胞水平上,CuCaM和CsAux集中在细胞的细胞核、细胞质、胞间层和细胞间隙中表达。由此表明,CuCaM和CsAux参与调控体细胞胚胎的发生和形态建成。 (2) 2,4-D处理对伏令夏橙(C.sinensis Osb.cv.Valencia)二倍体胚性愈伤组织体细胞胚胎发生和CsAux表达的影响。组织切片观察发现,2,4-D处理一周时,胚性愈伤组织在早期胚胎发生能力增强,非胚性愈伤相对减少,但随后胚性能力开始下降,胚性细胞开始退化,随着处理时间延长,胚性能力逐渐丧失,在胚性细胞团的表面开始产生大量非胚性的薄壁细胞。随着2,4-D的处理后体细胞胚胎发生能力的改变,CsAux表达水平也呈现先升后降。说明高浓度的2,4-D抑制柑橘体细胞胚胎发生和形态建成,对CsAux表达也有一定的调控作用。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S661.2;S666

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