鱼类病毒性神经坏死病的病原学研究及检测方法的建立

【摘要】：鱼类病毒性神经坏死病(Viral nervous necrosis,VNN)又称脑病和视网膜病(Viral encephalopathy and retinopathy,VER),是由鱼类病毒性神经坏死病毒(Viralnervous necrosis virus,VNNV)引起的鱼类传染病,该病对仔鱼和幼鱼危害很大,严重者在一周内死亡率可达100%,对成鱼也有很高的致死率。由于其极高的传染性和危害性,被国际兽医组织(OIE)列为重要的鱼类病害(OIE,2001)。 VNNV属于诺达病毒科β诺达病毒属,是迄今发现的最小鱼类病毒。VNNV能引起尖吻鲈、赤点石斑鱼、棕点石斑鱼、巨石斑鱼、红鳍多纪鲀、条斑星鲽、牙鲆和大菱鲆等多种海水鱼类中枢神经组织和视网膜的空泡化。目前该病毒引起的疾病在除非洲以外的世界其它地方迅速蔓延开来,给各国海水养殖业造成了巨大的损失,受感染的鱼类已达40余种。 我国沿海大规模网箱养殖的石斑鱼,由于受神经坏死病毒的感染,给育苗生产带来极大的损失。然而,目前对VNN开展的研究很少,其病毒特性、检测方法、预防和治疗等方面急需进行深入的研究。鉴于这种状况,我实验室从2005年开始,对我国海水鱼类进行VNNV监测,从福建等地养殖石斑鱼体内分离到6株VNNV,并对病毒特性、VNNV检测方法、疫苗设计等方面进行了研究,主要研究内容如下: 1.收集福建、广东、海南三地渔场的患病石斑鱼苗,对石斑鱼苗做组织切片,在脑和视网膜中可见有大量的空泡。细胞敏感性实验表明病鱼组织匀浆后接种到条纹月醴细胞系(striped snakehead,SSN-1)后,有9株可以引起SSN-1产生CPE,毒株传代3天左右细胞质开始出现空泡化,接种石斑鱼吻端细胞Grouperproboscis(GP)、鲤鱼上皮瘤细胞(epithelima popuasum cuprini,EPC)、肥头鲤细胞(pimephales promelas,FHM)在28℃、25℃、20℃时都没有细胞病变(CPE)出现。取接种VNNV的SSN-1细胞培养物,抽提病毒总RNA进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测,有6株可扩增出VNNV特异性条带,验证了该毒株为VNNV病毒,分别编号为SSS0602-0607。脂溶剂敏感试验(氯仿处理),热敏感试验(55℃30 min),酸碱敏感试验(pH=3和pH=11各1 h)的结果表明此毒株对氯仿不敏感,对热和酸碱都比较敏感。 2.选用本室分离保存的VNNV-SSS0602作为制备免疫原的材料,与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化后,免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾脏,分离脾细胞,与瘤细胞(SP2/0)融合后,用ELISA对细胞培养上清及杂交瘤细胞诱导的腹水检测,得到了3株可以稳定分泌抗VNNV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株即2-D5、2E8和4F4。选取2E8作为包被材料建立了VNNV病原检测ELISA方法,分别用该ELISA方法对VNNV及其它鱼类病毒阳性样品检测,表明该方法具有很好的特异性。用该ELISA方法对366份临床样品进行检测,同时用RT-PCR作为对照方法,结果表明该ELISA方法的特异性和敏感性分别为97.6%和91.4%;ELISA和RT-PCR两种方法检测结果的符合率为94.3%。该方法的建立,为VNNV的快速检测提供了可靠的方法,为VNNV的控制及净化养鱼环境提供了方便。同时,该方法可以在进出境检疫中,对批量鱼样品的检测。 3.本研究根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT—PCR反应条件进行优化,建立了用于检测的实时荧光RT—PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其它多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2pg/μL的总RNA,与普通RT-PCR的灵敏度对比试验表明,该方法的敏感度很高。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神经坏死病毒检测,结果发现40份阳性样品。这些结果表明,本研究所建立的实时荧光RT—PCR能对鱼类神经坏死病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高的优点。 4.从本室分离到的6株VNNV提取病毒基因组RNA。根据已报道的RNA2片段全序列设计引物,用RT-PCR方法特异性扩增出6株病毒的衣壳蛋白基因片段,分别连接到PMD18-T载体中,并进行序列测定和分析。结果发现,6个VNNV分离株的RNA2片段核苷酸序列的同源性在96.1%以上;推导的氨基酸序列同源性在79.6%-99.1%之间。根据RNA2片段核苷酸序列绘制的分子进化树表明,6个VNNV分离株在进化树同一分枝上,属于RGNNV基因型,与已报道的点带石斑鱼神经坏死病病毒(ECNNV)、巨石斑鱼神经坏死病病毒(ETNNV)及玛拉巴石斑鱼神经坏死病病毒(MGNNV)亲缘关系较近。试验结果表明,我国沿海养殖场发生的鱼类病毒性神经坏死病均由同一来源的病毒引起的,该基因型的鱼类神经坏死病毒在我国沿海养殖的石斑鱼中传播流行,并造成了较大的经济损失。 5.利用RT-PCR技术获得病毒性神经坏死病毒0603株的衣壳蛋白基因,将其插入到杆状病毒Bac-To-Bae表达系统的pFastBacⅠ质粒中,构建了pFastBac-cp质粒,转化DH_(10)Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-cp,脂质体介导转染Sf9细胞产生有感染力的重组杆状病毒AcNPV-cp。SDS-PAGE和Western-blotting分析可见大小约为37kD的特异性蛋白带,其可以与病毒性神经坏死病毒阳性血清反应,表明AcNPV-cp在Sf9细胞中成功地表达了病毒性神经坏死病毒的衣壳蛋白。电镜观察发现,CP蛋白可自行装配成病毒样粒子,其大小形态类似全病毒,并呈晶格状排列在细胞质中。

【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：S941