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《华中农业大学》 2008年
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鸡传染性法氏囊病抗体快速检测试纸条的研制及初步应用

张文通  
【摘要】:鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)引起的一种鸡的急性、高度接触性传染病,给世界各国的家禽养殖业带来了巨大损失。自IBDV发现至今,新的变异株及超强毒株的出现,使得传统疫苗已不能控制其流行,这进一步增加了该病的防制难度。 开展血清抗体检测是防制该病的重要措施之一,目前IBD血清抗体检测方法主要有琼脂凝胶扩散法、微量血清中和试验法及酶联免疫吸附试验法。但这些方法由于费时或成本高等因素的制约,主要用于实验室检测,不适合基层检测。因此,研制一种适合基层兽医或养殖个体进行快速检测IBD血清抗体的方法,对防制IBD是必要的。 本研究运用胶体金免疫层析技术,建立一种快速检测鸡传染性法氏囊病血清抗体的胶体金免疫层析方法,取得了如下成果: 1.IBDV结构蛋白(VP2)基因的原核表达及表达蛋白的纯化和免疫活性鉴定 携带IBDV-VP2基因的pKG-VP2表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)plys S中进行表达,并对表达条件进行优化,结果显示pKG-VP2在30℃条件下诱导6h后表达量最佳,表达物分子量约为66KDa。Western-blot证实重组蛋白具有较好的免疫学活性。经GST标签蛋白亲和层析柱纯化,我们获得高纯度的表达蛋白,浓度为1.01mg/mL,为IBDV抗体检测试纸条奠定了物质基础。 2.快速检测IBD血清抗体胶体金免疫层析试纸条的研制 (1)复苏和增殖抗鸡IgG Fc段杂交瘤细胞株,注射小鼠,产生腹水,通过辛酸-硫酸铵法纯化,获得了高纯度的抗鸡IgG Fc段单克隆抗体。 (2)采用柠檬酸三钠还原法,成功确立了20nm胶体金的制备条件:利用制备好的胶体金,对抗鸡IgG Fc单克隆抗体的胶体金标记条件的摸索,成功确立了最适标记条件:每ml胶体金最适添加7μL 0.1mol/L K_2CO_3和8μg抗鸡IgG Fc段单克隆抗体。 (3)用胶体金标记抗鸡IgG Fc段单克隆抗体作为探针,用纯化的VP2蛋白和兔抗鼠IgG分别作为检测线试剂和质控线试剂,研制了一种快速检测IBD血清抗体试纸条,并对其特异性和敏感性进行了测试。特异性结果显示,试纸条检测IBDV阳性血清时,检测线出现明显的紫红色条带,呈阳性反应;而鸡的其它疾病阳性血清如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和SPF鸡血清、生理盐水均显示阴性反应。用琼脂凝胶扩散试验检测临床血清样品获得20份阳性样品,然后分别用试纸条和琼脂凝胶扩散试验检测这20份血清样品的效价,结果显示试纸条较琼脂凝胶扩散试验敏感8倍。 3.快速检测IBD血清抗体胶体金免疫层析试纸条的临床初步应用 在建立的快速检测方法的基础上,我们研制出鸡传染性法氏囊病血清抗体快速检测试剂盒。用该试剂盒检测临床采集的216份血清样品,阳性检出率为60.19%,与琼脂凝胶扩散法符合率为68.52%。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S858.31

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