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《华中农业大学》 2008年
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鸡新城疫抗体免疫胶体金速测试纸条的研制及初步应用

张展英  
【摘要】:新城疫(Newcastle Disease,ND)又名亚洲鸡瘟,是由副黏病毒属新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一种多病型的高度接触性传染病,主要侵害鸡、火鸡、其它家禽和野禽类,也可感染人,是一种世界范围内禽类的重要的通报疫病,也是我国养禽业几十年来长期坚持免疫预防的主要传染病之一。新城疫的流行,给全球养禽业造成了巨大的经济损失。目前,对于ND的诊断方法主要有病毒分离、血凝和血凝抑制试验、ELISA、RT-PCR等,但由于这些方法耗时冗长或需要特殊的仪器设备及技术人员,难以满足简便、实时快速诊断的要求。 胶体金免疫层析方法是以条状纤维层析材料为固相载体,通过毛细管作用,以胶体金为示踪物来显示结果的一种新型的检测方法,具有操作简单、快捷,分析结果清楚、易于判断,且不需要任何仪器、成本低廉等优点,非常适用于现场检测及自动化检测分析。因此,该方法已在医学快速检测领域得到了迅猛发展,近年来已逐渐应用于动物医学领域的快速检测。 本研究利用原核表达的HN重组蛋白,采用间接法胶体金免疫层析法的原理,在国内率先建立了鸡新城疫抗体免疫胶体金速测技术,取得了如下研究结果: 1.新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(aN)基因的亚克隆、表达及蛋白纯化 设计一对分别带有BamHⅠ或XhoⅠ酶切位点的引物,利用PCR以及亚克隆的方法,从本室保存的表达质粒pGEX-KG-HN克隆出一段新城疫病毒La Sota系缺失胞质区、跨膜区的HN基因,将扩增产物克隆进pMD18-T载体,经限制性酶切鉴定,得到大小约1600bp的基因。再将其克隆到pGEX-6p-1中,与GST蛋白融合表达,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,共表达两种融合蛋白,分子量分别为88KD和58KD,Western blot印迹表明两种表达蛋白均具有较好的免疫反应活性。生物信息软件分析,HN-GST融合蛋白是疏水性蛋白,理论pI值为9.9。表达蛋白经亲和层析方法纯化得到纯度较高的HN-GST融合蛋白。 2.鸡新城疫抗体免疫胶体金速测试纸条的研制及其初步应用 采用柠檬酸三钠还原法,确立了20nm胶体金的制备条件;并利用制备好的胶体金,优化了鼠抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的标记条件:单抗的最佳标记pH为8.0,最适标记量为12μg/mL。 以纯化的HN-GST融合蛋白和兔抗鼠IgG分别作为检测线和质控线捕获试剂,以金标抗鸡IgG Fc段单克隆抗体为探针,初步建立了检测鸡新城疫病毒血清抗体的速测胶体金速测试纸条。重组HN-GST融合蛋白的最佳喷膜浓度为400μg/mL,兔抗鼠IgG的最佳喷膜浓度为1mg/mL,该试纸条与禽流感H5亚型、禽流感H9亚型、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊、鸡毒霉形体、滑液霉形体等阳性血清均无交叉反应,灵敏度比HI方法低一个滴度,该方法重复性好,与HI方法符合率为96.9%,结果可在10~15min内判定。用该试纸条检测了湖北、河南等地的150份被检鸡血清,总阳性率为84.7%。试验表明:该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、快速等优点,可用于鸡新城疫血清抗体水平的快速监测。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S858.31

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