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水稻纹枯病菌遗传多样性及侵染水稻早期上调表达基因的分析

谢甲涛  
【摘要】: 稻纹枯病严重制约水稻的产量和品质,已成为水稻上的首要病害。本论文以分离自我国湖北省、江西省、湖南省、江苏省、广西省等省份的纹枯病菌菌株为材料,研究了其遗传多样性;并以分离自武汉水稻田中的WH-1菌株为材料,分离获得了纹枯菌在侵染水稻早期上调表达的基因。主要结果如下: 自水稻叶鞘发病部位及纹枯病菌核共分离获得1088株菌株,结合形态学和分子生物学等鉴定方法,确认98.2%的菌株为茄丝核菌AG-1ⅠA(Rhizoctonia solaniAG-1ⅠA),另外有19株菌株为稻角担菌(Ceratobasidum oryzae-sativae),1株菌株为茄丝核菌AG-7,表明引发水稻纹枯病的病菌主要为茄丝核菌AG-1融合群中的ⅠA亚群,有性态为担子菌门瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)。对来自同一田块或来自不同省份的菌株进行了比较,发现它们在生长、菌丝直径、菌落形态和致病力等方面存在丰富的多样性。随机引物扩增多态性分析(RAPD)表明来自同一水稻田块的菌株间出现丰富的遗传分化现象,在0.83相似水平上,可以归于16个亚组;RAPD分析也表明来不同省份的71个菌株可以分为15个亚组,且与菌株来源没有显著关系。自广西桂林和湖北武汉的稻田中分别获得3株和1株表型特异的菌株,它们在生长、菌落形态和致病等方面与正常菌株均有显著性差异。 对分离自广西桂林的菌株GXE4进行了详细的研究。与正常菌株相比,菌株GXE4菌落颜色深,呈黄褐色,菌丝生长速率慢,产菌核数量少且不易产生菌核,对水稻没有致病力。采用真菌rDNA基因ITS区域序列、核型观察、菌丝融合试验,证实菌株GXE4是茄丝核菌AG-1融合群ⅠA亚群。菌株GXE4中存在一条独立于染色体和线粒体DNA外的DNA片段,大小约3.6 kb,命名为3.6-kb frags。3.6-kbfrags可以稳定的存在于菌株内,不能被抗生素、原生质体再生、SDS和溴化乙锭等操作消除掉。DNaseI、RNase、限制性内切酶、外切酶Ⅲ等降解试验表明3.6-kb frags具双链DNA特性,且3'端不含有发夹结构或蛋白质保护性结构。对3.6-kb frags进行了克隆和序列分析,发现在3.6-kb frags至少包含有两个大小类似、序列具有同源性的遗传因子,分别命名为3.6-kb frag-1和3.6-kb frag-2;3.6-kb frag-1没有氨基酸数超过110的阅读框,推定不具有编码功能;不完全序列分析表明3.6-kb frag-2也没有较大的阅读框。DNA杂交结果显示位于约23 kb和7.0 kb处还存在与3.6-kbfrags具明显杂交信号的DNA片段。根据这些研究结果初步推定3.6-kb frags可能是dsDNA病毒基因组的缺陷型DNA,或线性真菌质粒。 菌株RCOL-1分离自湖北武汉华中农业大学试验田。菌株RCOL-1对水稻没有致病力,它与双核菌稻角担菌(C.oryzae-sativa)在生长、菌落形态、菌核大小等表型上非常相似,与茄丝核菌AG-1融合群的菌株则有显著的差异。DAPI荧光染色核型分析表明,菌株RCOL-1的细胞核型没有规律,约95.9%为双核,2.8%为多核,1.3%为单核。通过特异性引物PCR扩增及DNA杂交证实RCOL-1中含有C.oryzae-sativae和T.cucumeris两种真菌的rDNA;进一步研究发现该菌株中存在4种类型的核糖体RNA的内转录间隔区(ITS,internal transcribed space),其中大部分的ITS序列与C.oryzae-sativae的相同,少部分的ITS与T.cucumeris相同;另有2种ITS是这两种真菌ITS的嵌合物,即ITS1与C.oryzae-sativae的ITS1相同,ITS2与T.cucumeris的ITS2相同,或ITS1与T.cucumeris的ITS1相同,ITS2与C.oryzae-sativae的ITS2相同。推定RCOL-1中存在4种类型的ITS是T.cucumeris中的rRNA基因向C.oryzae-sativae水平转移的结果。 以水稻纹枯病菌菌株WH-1和水稻9311为材料,采用抑制差减杂交(suppressionsubtractive hybridization,SSH)的方法,筛选获得了129个病菌侵染水稻初期(12 hpi)表达量明显增强的EST克隆。对表达量明显增强的克隆进行序列分析,结果发现96个克隆的序列与Genbank的序列具有一定程度的相似性,33个序列在数据库中没有相似性序列存在。对克隆了进行MIPS基因功能分类分析,推定这些上调表达基因的功能广泛,涉及到代谢(13%)、蛋白命运(9%)、信号传导(5%)、细胞防御(2%)等11类。其中包括了参与稻瘟病菌(M.grisea)、黑粉菌(U.maydis)等真菌致病过程的促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)、Cyclophilin、cyclin-dependent kinase等基因,它们也有可能参与纹枯病菌致病过程。


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