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《华中农业大学》 2009年
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氟损伤甲状腺机理研究

江鹏  
【摘要】: 氟是机体必需的微量元素,摄入适量能维持机体正常的生命活动,但它还是一种全身性毒物,其对机体内分泌腺的影响已成为近年来的研究热点。有实验表明氟能够引起甲状腺肿大,但是也有学者持反对意见。本实验分别复制SD大鼠氟中毒动物模型和氟化钠处理原代培养SD大鼠甲状腺细胞、大鼠甲状腺细胞系(fisher ratthyroid cell line,FRTL)。80只SD大鼠饮水中添加的氟化钠含量分别为0,50mg/L,100mg/L,200mg/L,原代培养的SD大鼠甲状腺细胞染氟化钠浓度分别为0,10μmol/L,100μmol/L,1000μmol/L,FRTL细胞染氟化钠浓度分别为0,1.25mg/L,2.5mg/L,5.0mg/L,10.0mg/L,20mg/L。运用电镜学、分子生物学、免疫学等技术研究氟对甲状腺激素代谢基因表达、功能蛋白表达和分布、细胞因子基因表达及分泌的影响,体外实验能解除下丘脑-腺垂体-甲状腺轴的影响,影响因素单一。本实验通过体内体外氟中毒实验阐述氟引起甲状腺肿大的分子机理,从而为揭示氟引起甲状腺损伤提供理论依据。 实验成功的复制SD大鼠氟中毒动物模型和制备体外氟中毒甲状腺细胞样品,通过形态学观察及竞争放射性免疫法测定反映甲状腺细胞结构和分泌激素功能的一系列指标,结果发现氟引起甲状腺激素T_3、T_4合成和分泌障碍及直接影响整个甲状腺细胞的生长和发育过程。 高氟(200mg/L)大鼠甲状腺血管增生和大面积增生结节,尤其氟对甲状腺细胞膜损伤严重;本实验通过甲状腺组织切片HE染色和扫描电镜等手段检测氟对甲状腺细胞的损伤,结果证明氟能够引起甲状腺肿大和一序列的损伤;运用RT-PCR、免疫细胞化学和免疫荧光组织化学等方法测定甲状腺相关功能酶类,以及部分相关蛋白和生长因子的表达与含量,结果发现甲状腺球蛋白(TG)、过氧化物酶(TPO)、钠碘转运体(NIS)、促甲状腺激素受体(TSHR)、血管内皮生长因子(VEGF)等与甲状腺功能密切相关的指标均表现异常;氟引起自由基代谢紊乱,致NO生成的功能酶以及相关生长因子(如iNOS和VEGF)表达受到影响发生显著变化,微血管增生,自由基和脂质过氧化物在甲状腺中蓄积,破坏了甲状腺滤泡上皮细胞结构和功能,干扰胶质的代谢,抑制甲状腺中碘的转运和有机化过程,干扰甲状腺过氧化物酶的活性,破坏甲状腺激素合成和分泌的各个环节,阻断了TSH对甲状腺细胞刺激作用,导致TSHR-cAMP无法发挥正常作用,甲状腺细胞功能下降。 此外本实验研究FRTL细胞在外界氟的作用下NO分泌、细胞因子基因表达和分泌的影响。运用RT-PCR、ELISA检测氟刺激FRTL细胞72h后IL-6 mRNA、IL-8mRNA、IFN-γmRNA,TNF-a mRNA水平和细胞上清中VEGF分泌量;同时westernblot测定NF-κB p65蛋白水平,结果表明:氟刺激这些细胞因子的表达,一方面通过抑制甲状腺激素代谢基因表达而影响甲状腺细胞甲状腺激素的分泌;另一方面,氟刺激细胞因子和NF-κB p65表达导致甲状腺细胞自身抵抗氟能力下降,甲状腺细胞功能下降。 氟化物影响甲状腺细胞的生长和发育,使细胞的形态发生改变,损伤程度与剂量有关,长期摄入过量氟可导致甲状腺发生结节性肿大;氟化物刺激iNOS、细胞因子和NF-κB p65异常的表达,这些因子通过抑制甲状腺激素代谢相关基因的表达进一步导致甲状腺细胞功能下降;氟化物造成甲状腺摄取和利用碘、甲状腺激素合成、贮存、分泌功能障碍,进而导致甲状腺结构和功能异常。
【关键词】:氟化钠 甲状腺激素 诱生型一氧化氮合酶 NF-κB p65蛋白 肿大 大鼠甲状腺细胞系
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R363
【目录】:
  • 中文摘要7-9
  • Abstract9-11
  • 英文缩略词11-12
  • 1 前言12-22
  • 1.1 文献综述12-21
  • 1.1.1 氟的研究简史12
  • 1.1.2 氟的生物学效应12-21
  • 1.2 本实验研究内容、目的和意义21-22
  • 2.实验材料和实验方法22-37
  • 2.1 实验方案22-23
  • 2.2 实验主要仪器设备和试剂23-25
  • 2.2.1 主要仪器设备23-24
  • 2.2.2 实验动物、FRTL细胞24
  • 2.2.3 主要药品和试剂24-25
  • 2.3 实验方法25-37
  • 2.3.1 甲状腺细胞原代培养,FRTL细胞传代培养和氟化钠处理原代培养甲状腺细胞和FRTL细胞25-26
  • 2.3.2 SD大鼠甲状腺组织样品的采集与处理26-27
  • 2.3.3 原代培养甲状腺细胞扫描电镜样品制备27-28
  • 2.3.4 NIS、TSHR、TPO、TG、iNOS和细胞因子基因的半定量RT-PCR,琼脂糖电泳步骤28-30
  • 2.3.5 免疫细胞化学检测TSHR分布30-31
  • 2.3.6 免疫荧光组织化学检测VEGF31
  • 2.3.7 半定量Western blot检测NF-κB p65蛋白表达31-33
  • 2.3.8 愈创木酚法测FRTL细胞TPO活性33-34
  • 2.3.9 放射性免疫法操作步骤34-35
  • 2.3.10 化学比色法测定细胞上清中NO含量35-36
  • 2.3.11 细胞上清中细胞因子VEGF和TNF-a测定36
  • 2.3.12 统计学分析36-37
  • 3 实验结果37-54
  • 3.1 原代培养SD甲状腺细胞生长情况观察37-38
  • 3.2 体外培养的甲状腺细胞扫描电镜38-39
  • 3.3 基因TG,TPO,NIS,TSHR;TNF-A,IL-8,IL-6,IFN-γ;iNOS半定量RT-PCR,电泳检测39-46
  • 3.3.1 总RNA质量鉴定39-40
  • 3.3.2 氟化钠处理的FRTL细胞72h TG基因表达40-41
  • 3.3.3 氟化钠处理的FRTL细胞72h TPO基因表达41
  • 3.3.4 氟化钠处理的FRTL细胞72h NIS基因表达41-42
  • 3.3.5 氟化钠处理的FRTL细胞72h TSHR基因表达42
  • 3.3.6 氟化钠处理的FRTL细胞72h iNOS基因表达42-43
  • 3.3.8 氟化钠处理的FRTL细胞72h TNF-a基因表达43
  • 3.3.9 氟化钠处理的FRTL细胞72h IL-6基因表达43-44
  • 3.3.10 氟化钠处理的FRTL细胞72h IL-8基因表达情况44
  • 3.3.11 氟化钠处理的FRTL细胞72h IFN-γ基因表达44-46
  • 3.4 半定量Western blot检测NF-KB P65蛋白表达46-47
  • 3.5 不同氟水平处理FRTL细胞TSHR表达免疫细胞化学染色47-49
  • 3.6 氟化钠处理FRTL细胞72h TPO活性检测49-50
  • 3.7 氟化钠处理FRTL细胞上清中FT_3,FT_4和TG含量50-51
  • 3.8 氟化钠处理FRTL细胞72h细胞上清VEGF,TNF-a含量51
  • 3.9 氟化钠处理FRTL细胞24h,48h和72h细胞上清NO含量51-52
  • 3.10 氟中毒致大鼠甲状腺肿模型复制结果52-53
  • 3.11 免疫荧光检测VEGF在氟致大鼠甲状腺组织表达53-54
  • 3.12 免疫荧光检测VEGF大鼠甲状腺组织阳性目标光密度54
  • 4 讨论54-64
  • 4.1 体外体内实验氟中毒模型的建立54
  • 4.2 氟中毒的分子机理54-64
  • 4.2.1 氟对甲状腺细胞表面结构的影响54-55
  • 4.2.2 氟对FRTL细胞甲状腺激素代谢相关基因表达及分布的影响55-64
  • 5 全文总结64-66
  • 参考文献66-72
  • 致谢72-73
  • 参加科研项目和发表论文73

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