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甜瓜坏死斑点病毒(MNSV)中国分离物全基因组序列的克隆和分析

温少华  
【摘要】: 甜瓜坏死斑点病毒(Melon necrotic spot virus,MNSV)是在甜瓜上发现的一种严重影响其品质和产量,对甜瓜生产可造成重大损失的危险性病原。除甜瓜外,它还可以侵染多种葫芦科植物,包括黄瓜、丝瓜、西瓜等我国重要栽培的蔬菜和瓜果。MNSV可以通过昆虫、真菌和种子等多种传播途径进行传播,极易扩散传播蔓延,因此,对我国的瓜果蔬菜产业的发展具有很大的威胁。MNSV在我国2007年第一次发现报道,研究甚少,克隆并分析其全长基因组序列对探明我国MNSV病原分子生物学特性,分析其致病机制,采用现代基因工程手段进行抗病毒研究非常重要。 本研究采用受甜瓜坏死斑点病毒系统侵染的甜瓜叶片为毒源材料,汁液摩擦接种到健康的甜瓜子叶上,然后提纯病毒粒子,提取病毒RNA。以植物总RNA或病毒RNA为模板,采用RT-PCR技术对MNSV基因组的中间序列分三个片段进行扩增。在已获得的三个片段的基础上,运用RT-PCR技术再对MNSV的5'和3'末端序列进行扩增,克隆和测序。采用DNAMAN生物学软件对照报道序列对获得的所有目标片段进行拼接,得了MNSV中国分离物基因组全长cDNA序列。序列分析结果表明:MNSV中国分离物基因组全长和报道序列全长大小相近,为4271 nt,有5个开放读码框架(open reading frame,ORF)和两个末端非翻译区组成。其中,ORF1位于88-894 nt处,长度为807nt;ORF2位于88-2463 nt处,长度为2376 nt;ORF3位于2442-2639 nt处,长度为197nt;ORF4位于2643-2828 nt处,长度为186nt;ORF5位于2815-3987 nt处,长度为1173 nt。分别编码p29、p89、p7A、p7B和p42五种蛋白,其大小分别为29 kDa、89 kDa、7 kDa、14kDa和42kDa。5'端和3'端非翻译区域(untranslated regions,UTRs)的长度分别为87 nt和284nt,无5'端帽子和3'poly(A)尾结构。 将所得到的MNSV中国分离物与其它国家报道的全基因组的核苷酸序列进行对比发现其与西班牙、以色列的一些MNSV分离物相似性较高,达到94%,与日本的几个分离物的序列相似性为87%—92%,存在着一定的变异。将MNSV编码p29、p89、p7A、p7B和p42蛋白的五个基因的核苷酸及其氨基酸序列分别与其他国家分离物相应基因的核苷酸及氨基酸序列进行相似性比较,各个基因的核苷酸序列之间存在着一定的差异,各个蛋白的氨基酸序列差异不大。


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1 温少华;甜瓜坏死斑点病毒(MNSV)中国分离物全基因组序列的克隆和分析[D];华中农业大学;2009年
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