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谷氨酰胺合成酶GlnA及其转录调节因子GlnR对2型猪链球菌致病力影响的研究

司有辉  
【摘要】: 2型猪链球菌病(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)是一种人畜共患病原菌,可以引起人和猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎等,病死率高,危害大。谷氨酰胺合成酶GlnA是氮代谢途径中的核心酶之一,是各种含氮物质如蛋白质、核酸及辅酶的氨基供体,是生物体必不可少的重要酶类之一。近年来,相关研究表明,氮代谢尤其是谷氨酰胺的代谢,不仅对许多病原菌的生存有着至关重要的作用,而且对其毒力也有着重要的影响。目前,S.suis 2中谷氨酰胺代谢及其对致病力的影响,国内外尚未有相关研究报道。为了探讨S.suis 2中谷氨酰胺代谢对致病力的影响及其可能机制,为进一步揭示S.suis 2的潜在毒力因子,阐明S.suis 2具体的致病机制提供借鉴,本研究以S.suis 2高致病株SC19为亲本菌株,以S.suis 2中谷氨酰胺合成酶基因glnA及其调节因子glnR为研究对象,分别构建了谷氨酰胺合成酶基因glnA的基因敲除突变株ΔGlnA、谷氨酰胺合成酶调节因子glnR的基因敲除突变株ΔGlnR及glnR/glnA双基因敲除突变株ΔGlnRA,同时利用pAT18穿梭质粒分别将发生缺失的基因及其启动子序列转入相应的基因敲除突变株中,通过PCR和RT-PCR等方法筛选鉴定,获得相应的具有功能代偿的互补菌株CΔGlnR、CΔGlnA和CΔGlnRA。并在此基础上,分析了glnR、glnA和glnR/glnA的缺失对S.suis 2基本生物学性状以及致病力的影响,主要研究内容包括: 1.温敏型自杀性重组质粒的构建 以S.suis SC19基因组DNA为模板,PCR分别扩增glnR、glnA编码基因的上下游片段,在限制性内切酶和T4连接酶的作用下,依次克隆到温敏型自杀性质粒pSET4s的多克隆位点上,构建glnR、glnA和glnR/glnA基因敲除突变株所需的重组质粒。 2.谷氨酰胺合成酶调节因子glnR的基因敲除突变株ΔGlnR、谷氨酰胺合成酶基因glnA的基因敲除突变株ΔGlnA、glnR/glnA双基因敲除突变株ΔGlnRA及相应互补菌株的构建 将重组质粒电转化SC19感受态细胞,通过PCR和抗性对目的菌株进行初筛,再应用RT-PCR、Real-time PCR、测序等方法进一步的验证,得到了相应的基因敲除突变株ΔGlnR、ΔGlnA和ΔGlnRA。在构建出的基因敲除突变株的基础上,利用pAT18穿梭质粒分别将发生缺失的基因及其启动子序列转入相应的基因敲除突变株中,通过PCR和RT-PCR等方法筛选鉴定,获得相应的具有代偿功能的互补菌株CΔGlnR、CΔGlnA和CΔGlnRA。 3.ΔGlnR、ΔGlnA、ΔGlnRA及相应的互补菌株CΔGlnR、CΔGlnA、CΔGlnRA基本生物学特性的研究 在相同的条件下,观察ΔGlnR、ΔGlnA、ΔGlnRA与野生株WT相比基本生物学性状的变化。结果发现,ΔGlnR、ΔGlnA和ΔGInRA在TSB培养基中能够稳定生长传代,突变株的菌落形态、溶血能力、抗吞噬能力、对HEp-2细胞的毒性及侵袭能力等没有发生明显变化。但是与亲本株相比,ΔGlnR、ΔGlnA和ΔGlnRA的生长速率都受到影响,另一方面,glnA的缺失还使S.suis 2对HEp-2细胞的粘附能力显著降低。 4.glnR、glnA对S.suis 2致病力的影响 以CD1小鼠为模型,测定ΔGlnR、ΔGlnA、ΔGlnRA的半数致死量,结果显示,gtnR、glnA及glnR/glnA基因敲除后,ΔGlnA和ΔGlnRA的毒力下降非常显著,而ΔGlnR的毒力下降并不明显。根据小鼠半数致死量的结果,选取同等剂量(10~8CFU)分别感染小鼠,其中glnA、glnR/glnA基因敲除突变株感染临床发病率降低,存活率100%,感染小鼠脑和肺组织的病理切片显微镜下观察均正常,无明显可见病理损伤;而glnR基因敲除突变株感染组的发病率和存活率与WT相比无明显变化,感染小鼠的脑和肺组织皆发生严重的病理损伤。组织器官活菌动态分布实验结果显示,ΔGlnA和ΔGlnRA感染组小鼠的各组织器官活菌数显著降低,说明谷氨酰胺代谢在S.suis2感染过程中,尤其在粘附和定植过程中发挥着重要的作用。 5.S.suis 2中谷氨酰胺代谢的可能机制 利用荧光定量PCR比较ΔGlnR、ΔGlnA和WT部分基因的表达谱差异,结果显示,与WT相比,在检测的29个基因中,ΔGlnR和ΔGlnA有18个基因转录水平发生了显著的变化,这些基因主要与糖和氮的代谢有关,其中磷酸基载体蛋白(phosphocarrierprotein,HPr)、精氨酸脱亚氨酸(Arginine deiminase,areA)和转录抑制因子CodY与很多致病菌的毒力有关。


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