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《华中农业大学》 2009年
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水稻T-DNA插入突变体的构建及同源染色体配对基因PAIR3的分离与鉴定

袁文雅  
【摘要】:水稻是重要的粮食作物,也是禾谷类作物功能基因组研究的模式植物。突变体是研究基因功能最直接、最有效的途径之一,因此构建水稻大型突变体库是在全基因组水平上大规模、全面、系统的研究基因功能的重要技术平台。农杆菌介导的T-DNA转化因其在水稻基因组中相对随机的分布规律,高效的转化体系,稳定的后代遗传及简单的遗传背景,被广泛的用于水稻突变体库的构建。本研究通过农杆菌介导的T-DNA随机插入构建突变体库,在正常栽培条件下种植T_1代分离群体,目测筛选有明显突变表型的家系并进行突变表型与T-DNA纯合插入共分离的检测,并针对共分离家系,分离克隆相应基因并进行其功能分析。主要研究结果如下: 1.创建独T-DNA转化单株30,579株。 2.筛选9,193个突变家系,观察到有突变表型的家系1,417个,突变率为15.4%,得到3个共分离家系:03211UG73,03211UL95,03211UF78。突变性状分别为:白化苗,半矮,完全不育。对03211UF78进行详细的突变表型分析并分离克隆相应基因PAIR3。 3.03211UF78家系分离出的不育突变体命名为pair3-1。相对于分离出的野生型单株,其突变体在营养生长阶段及花序,花的发育都没有任何差别;但在开花时,突变体的花药不外露,至成熟时,突变体完全不育。KI-I_2溶液染色显示突变体的花粉粒几乎全不着色,表明突变体雄性不育。野生型花药做父本,pair3-1做母本,杂交不结实,表明突变体雌性也不育。 4.03211UF78家系的T_1代及T_2代共分离检测显示完全不育的性状与T-DNA纯合插入完全共分离。 5.从本室突变体库中得到等位突变体05211HE71,命名为pair3-2,突变性状也是完全不育,T1代共分离检测也是完全共分离。 6.转双链RNAi载体的转化单株育性明显降低,35%(21/60)单株为完全不育。部分单株取RNA做半定量PCR分析显示:转基因单株的育性与PAIR3基因的表达相对应。 7.RT-PCR及RACE确定PAIR3的基因序列。PAIR3基因在TIGR中编号为LOC_Os10926560,基因全长为6,930bp(转录起始至终止),全长cDNA为2,963bo,由11个外显子及10个内含子组成,编码一个包含844个氨基酸的蛋白。BLASTN分析显示PAIR3基因是一个新基因,在已完成基因组测序的物种中没有找到同源基因或蛋白。基因结构预测只有一个coiled-coil结构域。 8.花药半薄切片显示:相对于野生型花药的发育,pair3花粉囊壁的发育没有受到影响;花粉母细胞的发育及其随后的小孢子也没有明显变化;但在花粉有丝分裂时期至成熟花粉时期,花粉粒皱褶、干瘪,没有活力。 9.胚囊石蜡切片显示:相对于野生型胚囊的发育,pair3胚囊在功能大孢子形成时期出现异常,大孢子减数分裂后靠近合点端的大孢子不是变大形成功能大孢子,而是随着另三个靠近珠孔端的大孢子相继降解而降解。最终突变体胚珠中没有胚囊的结构,只见一些珠心组织降解的痕迹。 10.花粉压片染色观察突变体的减数分裂过程。结果显示:pair3在终变期可见24条染色单体及后期Ⅰ染色体随机分离。我们推测PAIR3基因通过影响水稻同源染色体的配对,造成性母细胞减数分裂中染色体的随机分离,从而导致pair3雌雄性都不育。 11.半定量PCR分析显示:PAIR3基因在稻穗中有表达,在茎、叶、叶鞘等营养器官中不表达或很低水平的表达,这与突变体在营养阶段没有表型而只造成雌雄都不育相对应;PAIR3基因在突变体(pair3-1和pair3-2)中都不表达,表明两个等位突变体都是功能缺失(loss-of-function)的突变体;PAIR3基因在不同长度的穗子中都有表达,但是表达趋势是先上升再下降,在穗长为4.5cm至11 cm时表达最强,而这时正是性母细胞减数分裂时期。 12.原位杂交结果显示:PAIR3基因在花药早期的花粉囊壁细胞及孢原细胞中有微弱表达,随后在小孢子母细胞、四分体、刚游离出的小孢子中高表达,在小孢子中表达慢慢降低至液泡化大孢子期完全不表达,之后又特异的在降解中的绒毡层中表达;PAIR3基因在胚囊早期的孢原细胞及珠被原基中有微弱表达,随后在整个胚珠、珠柄、子房内壁中表达,但主要是在大孢子母细胞减数分裂时或刚完成时表达最强。因此PAIR3基因主要是在减数分裂时期的性母细胞中高表达,表明PAIR3在减数分裂中起作用。PAIR3表达模式与突变表型相对应。 13.目前水稻中已报道的影响减数分裂的5个基因(PAIR1、PAIR2、MEL1、OsDMC1、OsRAD21-4)在pair3-1及野生型中的表达无差异,表明PAIR3可能不参与以上基因的表达调控。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S511

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