收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

副猪嗜血杆菌感染和应激相关基因的鉴定与功能研究

金卉  
【摘要】:副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪的一种呼吸道共栖菌,在特定条件下可侵入机体而引起严重的全身性疾病,被称为副猪嗜血杆菌病或革拉泽氏病(Gl(a|¨)ser's disease)。该病以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎和肺炎为主要特征,已经成为影响全球养猪业最为严重的细菌性传染病之一。作为一种新发传染病的病原,人们对其毒力相关因子和致病机理知之甚少,严重制约了诊断与防治技术的研究。病原菌在感染过程中,必须适应动物机体内温度、pH、渗透压、氧和营养物质供应等环境应激的变化,并产生相应的应答反应,因此,广义的毒力相关因子应该包括那些与体内、外环境应答有关的所有病原因子。这些感染相关因子的鉴定与表达调控的研究,不仅有利于病原菌致病机理的解析,而且对疫苗、药物和诊断试剂的设计与研制具有重要的指导意义。本研究运用转录序列选择性捕获(Selective Captureof Transcribed Sequences,SCOTS)技术分别鉴定了HPS在感染猪肺组织中、体外缺铁和高温条件下表达上调的基因共113个,并对其中部分基因编码的蛋白质的免疫原性及与宿主脑组织的相互作用进行了研究,现将主要研究的结果报告如下: 1.副猪嗜血杆菌感染和应激相关基因的筛选 副猪嗜血杆菌在猪肺组织中上调表达基因的鉴定与功能分析:应用SCOTS技术共鉴定到HPS 0165株在感染猪肺组织中上调表达的基因38个,这些基因按照功能可以分为以下5类:细胞表面蛋白3个、代谢和应激相关蛋白24个、调节蛋白3个、转运蛋白4个、和未知功能蛋白4个。实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析进一步验证了SCOTS结果的可靠性,同时发现黏附素YadA和唾液酸合成酶SiaB两种重要的毒力因子在HPS感染猪的多数组织中均表达。其中YadA在感染猪肺组织中表达量最高,提示它与HPS在猪肺脏的定植有关;而SiaB在感染猪脑组织中表达量最高,可能直接或者间接参与HPS突破血脑屏障和脑膜炎的发生。此外,运用反向Southern Dot Blot技术进一步研究了上述38个HPS体内表达基因与缺铁、厌氧和高温应激之间的关系,为其表达调控及功能的深入研究奠定了基础。 副猪嗜血杆菌缺铁应激基因的鉴定:运用SCOTS技术鉴定了HPS在铁限制条件下上调表达的基因36个,分别编码细胞表面蛋白、转运蛋白和结合蛋白、与物质代谢和能量代谢相关的酶或蛋白质。为了验证SCOTS的结果,利用实时荧光定量qRT-PCR技术有6个基因被选作转录水平分析验证。其中recN和hrpA同DNA复制与修复相关,ccmA和acrB同呼吸和电子传递链相关,而ptnC和gmhA同糖代谢相关。结果显示:副猪嗜血杆菌在铁限制条件下上调表达了所有这6个基因高于33倍于正常培养条件。 副猪嗜血杆菌在高温条件下上调表达基因的鉴定:应用SCOTS技术筛选到副猪嗜血杆菌在高温条件下上调表达的基因39个,并对所筛选出的基因进行功能注释与分类。这39个基因可以按功能上分为7类:DNA代谢,能量代谢,糖代谢,氨基酸和蛋白质的合成,脂肪酸代谢,转运,调节蛋白和未知功能。通过SCOTS技术在高温条件下筛选出来的HPS上调表达的基因许多都是由转录调节因子。σ~(32)调控的产物。 2.副猪嗜血杆菌感染和应激相关蛋白质的免疫原性研究 本研究从SCOTS技术筛选获取得到的感染与应激相关的基因中,依次通过生物信息学功能预测,信号肽预测,流式细胞术以及间接免疫荧光检测候选抗原蛋白与猪肺上皮细胞(St.Jude porcine lung cells,SJPLC)的互作与黏附,最终选用了5个候选抗原蛋白,这些抗原的基因在副猪嗜血杆菌的其他血清型中遗传保守,有望能提供交叉保护作用。通过动物保护力实验,从中成功得筛选到一个较好的免疫保护性抗原四型菌毛PilA。在PilA重组蛋白对仔猪免疫保护试验中,从攻毒后死亡率,心脏、肺脏和腹腔的纤维素化病变情况看,PilA的重组蛋白免疫组与全菌灭活苗组免疫保护的效果几乎相同,表明重组蛋白苗及全菌灭活苗免疫均具有一定的免疫保护效果,可以作为新型疫苗的有效成分,并将为研究HPS的致病机理提供新的思路。 3.副猪嗜血杆菌感染和应激相关蛋白质与宿主蛋白质的相互作用研究 运用酵母双杂交技术从猪脑组织cDNA文库中筛选到与副猪嗜血杆菌毒力因子PilA、AcrB、SiaB相互作用的蛋白质E2A、AP-3和ClqA。筛选前诱饵质粒进行了自激活检测,筛选后又进行了回转实验验证,同时通过pull-down体外验证证实这三对的确能相互结合,降低了假阳性发生率,该结果为副猪嗜血杆菌突破血脑屏障的分子机制的研究奠定了基础。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 母安雄,应小飞,陶益,杨宗照;副猪嗜血杆菌的研究进展[J];中国畜牧兽医;2005年11期
2 王平利;梁宏德;陈福伟;焦喜兰;艾伟昌;;猪副猪嗜血杆菌感染的病理学观察[J];河南农业科学;2005年12期
3 张晓艳;戴奇峰;于晓东;李绍荣;刘攀峰;曹文杰;;浅谈对副猪嗜血杆菌的新认识[J];现代畜牧兽医;2006年12期
4 王丽荣;董永军;杭柏林;赵春梅;王三虎;梁美兰;;副猪嗜血杆菌的分离鉴定[J];西北农业学报;2007年04期
5 张欣;崔敏;罗满林;;猪胸膜肺炎放线杆菌与副猪嗜血杆菌分离鉴定和药敏试验[J];养猪;2008年01期
6 钟登科;魏建超;张训海;路振香;金光明;李文超;龚争;;副猪嗜血杆菌安徽株分离鉴定与药敏试验[J];养猪;2008年01期
7 周迎芳;李逢慧;罗超;廖艳;冯帅媚;;副猪嗜血杆菌研究现状[J];中国畜禽种业;2008年21期
8 洪学;;“赛福欣”对预防猪副猪嗜血杆菌的试验效果[J];当代畜禽养殖业;2008年12期
9 郭建强;王传宝;张彬;;副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验[J];兽医导刊;2008年07期
10 李艳;刘静;Alex Olvera;Joaquim Segales;;副猪嗜血杆菌感染诊断方法和最新基因分型方法的研究进展[J];国外畜牧学(猪与禽);2008年05期
11 方泉明;黄冬艳;;副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其对小白鼠致病性试验[J];江西畜牧兽医杂志;2008年05期
12 陈小飞;岳华;张彬;杨帆;夏梦芸;刘海燕;汤承;;副猪嗜血杆菌的分离鉴定[J];养猪;2009年01期
13 高鹏程;储岳峰;赵萍;贺英;逯忠新;;副猪嗜血杆菌对部分常用实验动物的致病性试验[J];畜牧兽医学报;2009年01期
14 方泉明;黄建珍;黄冬艳;;副猪嗜血杆菌江西株的分离鉴定及药敏试验[J];中国畜牧兽医;2009年04期
15 马艳平;刘永生;张杰;;副猪嗜血杆菌检测技术研究进展[J];现代生物医学进展;2009年08期
16 冯小明;储岳峰;贺英;高鹏程;赵萍;郭晗;樊祜卿;逯忠新;;副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用[J];中国兽医科学;2009年07期
17 马艳平;刘永生;张杰;;副猪嗜血杆菌生物被膜形成与功能的研究进展[J];江苏农业科学;2009年03期
18 姜八一;黄解珠;何启盖;;副猪嗜血杆菌的临床分离鉴定与耐药性分析[J];养猪;2009年04期
19 王金合;石冬梅;郭素琴;祁画丽;陈益;;副猪嗜血杆菌的分离鉴定及自家灭活苗的研制[J];中国畜牧兽医;2009年08期
20 宋德平;王萍;黎家祥;花象柏;邬向东;黄冬艳;;江西省多个猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验[J];养猪;2009年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 胡明明;常月红;张艳禾;司薇;谢芳;于申业;刘慧芳;刘思国;王春来;;副猪嗜血杆菌“菌影”的制备[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年
2 孙清莲;荆汝顶;毕征;郝付全;刘海林;;某猪场副猪嗜血杆菌等病的诊治报告[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年
3 车勇良;陈少莺;周伦江;王隆柏;魏宏;庄向生;;副猪嗜血杆菌的分离与鉴定[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会论文集[C];2007年
4 王东方;;副猪嗜血杆菌的诊断与治疗[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会论文集[C];2010年
5 朱杰仪;刘健;罗满林;;副猪嗜血杆菌毒力基因的研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(上册)[C];2009年
6 周宗清;邹勇;王英;张春玲;蒋凤英;;多重感染猪场副猪嗜血杆菌的分离与鉴定[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
7 周学利;蔡旭旺;陈焕春;徐晓娟;赵雅欣;陈品;张璇;;副猪嗜血杆菌的耐药性研究[A];中国畜牧兽医学会养猪学分会第五次全国会员代表大会暨养猪业创新发展论坛论文集[C];2010年
8 张瑜;郑杰;张庆霞;乔彦良;赵玉军;范国兵;;一例副猪嗜血杆菌的分离鉴定[A];中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会(第三届中国兽药大会学术论坛)论文集[C];2010年
9 何海健;陆国林;熊永忠;;浙江省副猪嗜血杆菌分离株的生物学特性[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年
10 尹秀凤;王艳;姜平;;副猪嗜血杆菌的流行病学调查[A];第六届全国会员代表大学暨第11次学术研讨会论文集(上)[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 金卉;副猪嗜血杆菌感染和应激相关基因的鉴定与功能研究[D];华中农业大学;2009年
2 陈品;副猪嗜血杆菌耐药性分子机制研究[D];华中农业大学;2011年
3 靳国旺;安阳地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及蜂胶灭活苗的制备[D];中国农业大学;2015年
4 付书林;副猪嗜血杆菌重要免疫原性相关蛋白发掘及GAPDH免疫调节机理研究[D];华中农业大学;2013年
5 汪洋;副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的转录组学研究与环介导恒温扩增法的建立[D];华中农业大学;2012年
6 周明光;副猪嗜血杆菌新型免疫原性蛋白的发掘与鉴定及细胞毒素的鉴定与功能研究[D];华中农业大学;2011年
7 都启晶;副猪嗜血杆菌基因组表达文库的构建与其荚膜多糖输出蛋白基因的筛选和免疫原性研究[D];四川农业大学;2010年
8 蔡旭旺;副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究[D];华中农业大学;2006年
9 乐敏;副猪嗜血杆菌基因组学及毒力相关因子研究[D];华中农业大学;2010年
10 李军星;副猪嗜血杆菌分子流行病学调查及其HSP70对PRRSV结构蛋白GP3/GP5的免疫协同作用研究[D];南京农业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 苗立中;副猪嗜血杆菌荧光定量PCR方法建立及其分离株高密度发酵研究[D];吉林大学;2012年
2 宋凤香;德州地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及灭活疫苗免疫保护效力研究[D];山东农业大学;2009年
3 郭志伟;副猪嗜血杆菌保护性抗原的筛选与鉴定[D];华中农业大学;2009年
4 李逢慧;复合环媒恒温基因扩增技术的研究[D];湖南农业大学;2009年
5 万世平;上海地区副猪嗜血杆菌分子流行病学调查研究及基因组文库的构建[D];南京农业大学;2009年
6 何丽丽;广东地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及动物感染试验研究[D];南京农业大学;2009年
7 尹秀凤;副猪嗜血杆菌流行病学与人工感染猪病理学研究[D];南京农业大学;2005年
8 任慧君;副猪嗜血杆菌脂多糖—蛋白结合疫苗的制备及免疫原性研究[D];华中农业大学;2011年
9 杨显超;副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其在模拟体内发病条件下培养的蛋白组学研究[D];南京农业大学;2011年
10 朱晓凯;副猪嗜血杆菌外膜蛋白双向电泳及间接ELISA方法建立[D];吉林农业大学;2012年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 行唐县兽医防疫站 王金合;副猪嗜血杆菌和附红细胞体混感的诊治[N];河北科技报;2011年
2 沙河市畜牧水产局 胡文英 付丽伟;猪瘟与副猪嗜血杆菌混感的综合防控[N];河北科技报;2014年
3 ;一例副猪嗜血杆菌和传染性胸膜肺炎混合感染的治疗心得[N];中国畜牧兽医报;2009年
4 ;一例副猪嗜血杆菌和传染性胸膜肺炎混合感染的治疗心得[N];中国畜牧兽医报;2009年
5 石家庄市行唐县兽医防疫站 王金合;副猪嗜血杆菌和附红体混合感染咋治疗[N];河北农民报;2011年
6 张伟;一例猪圆环病毒与副猪嗜血杆菌混合感染的诊治[N];中国畜牧兽医报;2011年
7 谭海珍;鉴别猪跛行 对症好防控[N];河南科技报;2012年
8 石家庄市畜牧水产局 于振梅 郝立宾;猪流行性感冒、链球菌病、副猪嗜血杆菌混合感染的诊治[N];中国畜牧兽医报;2007年
9 山东省沂水县职教中心高级畜牧师 李连任 提供;猪:关节发病不要急 查找病因要仔细[N];河南科技报;2010年
10 山东省沂水县职教中心 李连任;春季谨防猪跛行性疾病[N];河北科技报;2010年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978