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《华中农业大学》 2009年
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多胺对小菜蛾嗅觉影响机制的研究

张志春  
【摘要】: 昆虫的嗅觉在昆虫寻找配偶和食物、搜寻产卵场所、躲避外界不利环境的伤害等起着非常重要的作用。多胺是生物体内普遍存在的具有生物活性的一类低分子量含氮碱类,是精氨酸(Arg)代谢过程中产生的一类低分子胺,主要有腐胺、亚精胺和精胺。研究表明多胺能够参与昆虫行为的调节过程。本课题以小菜蛾Plutellaxylostella为研究对象,对其嗅觉相关蛋白以及多胺对小菜蛾嗅觉相关蛋白基因表达的影响进行了研究,主要结果如下: 1小菜蛾嗅觉相关蛋白基因的克隆和序列分析 利用RT-PCR和RACE技术克隆到小菜蛾2个普通气味结合蛋白(GOBP)基因PxylGOBP1(GenBank登录号:ABY71034)和PxylGOBP2(GenBank登录号:ABY71035),其核苷酸序列全长分别为504 bp和483 bp,编码168和163个氨基酸残基,这两个基因编码氨基酸序列和其它鳞翅目昆虫GOBP的氨基酸序列比对同源性较高(70%~80%),但是PxylGOBP1和PxylGOBP2的同源性只有50%,说明它们属于不同的GOBP类群;1个信息素结合蛋白(PBP)基因PxylPBP1(GenBank登录号:FJ201994),其核苷酸序列全长为504 bp,编码164个氨基酸残基,这个基因编码氨基酸序列和其它鳞翅目昆虫PBPs比对同源性较高(70%~80%);1个化学感受蛋白(CSP)基因PxlyCSP1(GenBank登录号:FJ361903),其核苷酸序列全长405 bp,编码134个氨基酸残基,该基因编码氨基酸序列和其它鳞翅目昆虫CSP的氨基酸序列比对同源性较高(70%~80%)。 2小菜蛾嗅觉相关基因的组织和时空表达 RT-PCR结果表明,小菜蛾PxylGOBP1、PxylGOBP2和PxylPBP1在雌雄触角中均有表达,在其他组织中(去触角头、足、腹部和翅)均没有表达,而小菜蛾PxylCSP1不仅在雌雄触角中表达,在其他组织(去触角头、足、腹部和翅)中也有表达。Real-timePCR研究表明PxylGOBP1、PxylGOBP2、PxylPBP1和PxylCSP1的表达水平因被测小菜蛾的雌雄、日龄、组织不同和交配与否而异,这些基因在卵、幼虫不同龄期和蛹期的表达量仅为0.01%左右;在卵、幼虫和蛹期,PxylGOBP1的表达量均比PxylGOBP2高出3倍左右,而在成虫期PxylGOBP1的表达量仅是PxylGOBP2的1/5,PxylGOBPs在1龄幼虫时的表达量在整个幼虫期最高,可能是和其一孵化出来就寻找寄主有关;PxylPBP1的表达量在小菜蛾卵和蛹期相对幼虫期较高,随着龄期的增长表达量降低,到3龄幼虫达到最低值后表达量呈上升趋势,在成虫期各时段雄蛾触角中PxylPBP1的表达量均比雌蛾高,是雌蛾的3-30倍,在雌雄蛾交配后,PxylPBP1的表达量均比交配前高;PxylCSP1的表达量在小菜蛾卵期和蛹期表达量较幼虫期明显低,其仅为其的1/10左右,4龄幼虫表达量在整个幼虫期表达量最高,这些可能和小菜蛾幼虫取食有关,成虫期在羽化4-8h小菜蛾PxylCSP1表达量较高,交配后雄虫PxylCSP1的表达量明显比交配前(羽化16 h)低,而雌虫却明显比交配前(羽化16 h)高。综上所述,小菜蛾嗅觉相关基因的表达和小菜蛾的雌雄、发育状态和交配与否密切相关,这些是否和小菜蛾可塑性行为相关还有待我们进一步研究。 3多胺对小菜蛾嗅觉相关基因表达的影响 腐胺处理后增高了未交配小菜蛾PxylGOBP1的表达,但却明显抑制了交配小菜蛾PxylGOBP1的表达;腐胺处理后明显抑制了小菜蛾PxylGOBP2的表达,仅对羽化初期(0、4h)的雌蛾触角中PxylGOBP2的表达具有增强作用;明显增强了交配雄蛾PxylPBP1的表达,但却明显减弱了交配雌蛾PxylPBP1的表达;经腐胺处理后,雌雄小菜蛾不同时段PxylCSP1的表达量明显降低,只有羽化16h时表达量升高。 亚精胺处理后明显抑制了小菜蛾PxylGOBP1的表达,但在羽化4h时雌雄蛾和交配后雌蛾PxylGOBP1的表达量和对照丙酮处理比明显增高;亚精胺处理后明显抑制了小菜蛾PxylGOBP2的表达,但却促进了羽化初期(0、4h)小菜蛾雌蛾PxylGOBP2的表达;经亚精胺处理后小菜蛾雌雄蛾羽化不同时间触角中PxylPBP1的表达均明显受到抑制;亚精胺处理后明显抑制了小菜蛾PxylCSP1的表达,但在羽化4h时雄蛾和交配后雌蛾PxylCSP1的表达量和对照丙酮处理比明显增高。 经精胺和DFMO处理后,小菜蛾PxylGOBP1、PxylGOBP2和PxylCSP1表达被明显抑制在一个很低的水平(和对照丙酮处理相比);经精胺处理后,对小菜蛾雄蛾触角中PxylPBP1的表达具有促进作用,但抑制了交配后雌雄蛾触角中PxylPBP1的表达;经DFMO处理后对雌雄蛾不同时期触角中PxylPBP1的表达均具有抑制作用,但对羽化4h和16h雌蛾触角中PxylPBP1的表达具有增强作用。 综上所述,多胺能调节小菜蛾触角中嗅觉相关基因的表达,这种调节能力因处理、雌雄、羽化时间和交配与否有关。 4小菜蛾嗅觉相关蛋白基因的原核表达及蛋白纯化 在成功克隆小菜蛾PxylGOBP1、PxylGOBP2、PxylPBP1和PxylCSP1基因的基础上,利用基因重组的方法将这4个基因构建到原核表达载体pET-22b(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,表达产物经SDS-PAGE检测,所表达的4个重组蛋白大小约为19kD、22kD、18kD和14kD左右,主要以包涵体形式存在。超声波破碎离心后,用8mol/L尿素对包涵体进行溶解,经DE52阴离子亲和层析柱一步法纯化得到高纯度重组蛋白,并且回收率也很高。 5小菜蛾嗅觉感器的扫描电镜观察 利用扫描电镜对小菜蛾触角及其感器进行观察和研究。结果表明,小菜蛾触角为丝状,其上共有12种感器:毛形感器、刺形感器、腔锥形感器、鳞形感器、栓锥形感器、具弯端感器、巨形感器、锥形感器、端毛、钟形感器、棒形感器、叉形感器。对各种感器的形态、分布特点进行了描述,根据感器的分布、形态特征结合已有的文献描述,分析各感器可能具有的功能。为揭示小菜蛾的行为反应、识别机制和探索利用小菜蛾行为控制剂防治害虫奠定理论基础。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S433

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