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晚疫病菌诱导的两个马铃薯泛素连接酶基因的克隆与功能分析

倪雪梅  
【摘要】: 泛素-蛋白酶体通路在植物防卫反应(包括过敏性反应)中发挥重要作用,泛素连接酶(ubiquitin ligase, E3)则是参与这一过程的重要组分。本研究旨在通过克隆和分析与马铃薯晚疫病抗性相关的泛素连接酶家族中的成员,初步揭示这类基因在马铃薯晚疫病垂直抗性和水平抗性中的调控作用,或它们在马铃薯防御晚疫病菌侵染的信号传导网络中的作用,为进一步深入开展抗性机理研究奠定基础。 本实验室从晚疫病诱导的马铃薯水平抗性材料构建的cDNA文库中筛选出两个与烟草Avr9/Cf-9 rapidly elicited protein (ACRE,具有泛素连接酶E3活性)基因有很高同源性的EST片段(10-A12和08-E12)。本研究中,我们克隆了这两个EST片段所代表的基因,StRFP和StPUB,并研究了其生物学功能。 StRFP基因的全长cDNA为1354 bp,包含一个789 bp的开放阅读框(ORF),编码262个氨基酸,含有高度保守的RING-H2型RING指结构域、跨膜结构域和GLD结构域,是一个新的马铃薯ATL (Arabidopsis toxico para levadura)蛋白。StRFP基因位于马铃薯第3条染色体上,不含内含子。马铃薯基因组中可能有1-2个StRFP基因拷贝或与之同源性高的基因。利用洋葱表皮细胞进行的StRFP-GFP融合蛋白亚细胞定位结果显示,StRFP在细胞膜上或膜外表达。RT-PCR分析结果表明,StRFP基因表达无组织特异性,在根、茎、叶、花、茎尖、匍匐茎和块茎等各种组织器官中组成型表达,但不同部位的表达水平有差异。离体叶片的晚疫病原菌接种表明,StRFP在接种24 h后表达增强,水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)和机械伤害处理能诱导其表达,乙烯(ETH)不能诱导其表达。试管苗在外界环境胁迫下的表达模式表明,StRFP对所研究的各种环境因素如NaCl、20%PEG、脱水、40℃热激和4℃低温都有响应,但对盐胁迫和渗透胁迫的反应更明显。为了进一步研究其功能,我们分别构建了CaMV 35S驱动下的StRFP基因正义表达载体和RNAi抑制表达载体,采用根癌农杆菌介导法转化鄂马铃薯3号(EP3)的试管薯,分别获得超量表达株系27个和干涉株系6个。Southern杂交表明每个转基因植株有1-3个拷贝。晚疫病病原菌接种实验表明,与未转基因对照相比,超量表达的转基因株系更抗病,而抑制表达的株系更感病,说明StRFP基因为马铃薯抗晚疫病反应中的正向调控因子。 StPUB基因全长2483 bp,包含一个2175 bp的ORF,编码724个氨基酸,GenBank登记号为EF091878。序列分析表明,StPUB蛋白具有保守的UND/U-box/ARM结构域,与烟草ACRE276的氨基酸序列有89%的同源性。从马铃薯水平抗性材料(386209.10)、垂直抗性材料(鄂马铃薯3号,EP3)和感病材料(转心乌,ZXW)中获得StPUB基因的基因组DNA信息,序列分析表明该基因不含内含子,且在三种不同抗性材料中大小一致,同源性达到97.7%。通过TAIL-PCR与生物信息学分析,推测StPUB基因包含三个启动子序列,可能位于马铃薯第2条染色体上。Southern blot杂交结果表明,马铃薯基因组中可能有2-3个StPUB拷贝或与之同源性高的基因。离体叶片的诱导表达模式研究表明,晚疫病病原菌接种24 h后,StPUB表达明显增强,而且在三种不同的马铃薯抗性材料中表达趋势一致;SA、ABA和机械伤害能激活StPUB表达,而MeJA和ETH不能诱导其表达。试管苗在外界环境胁迫下的RT-PCR结果显示,热激(40℃)、低温(4℃)、20%PEG或NaCl能诱导StPUB表达。采用RNAi技术,构建了抑制StPUB基因表达的载体,并利用农杆菌介导的遗传转化法导入马铃薯垂直抗性品种EP3中,共获得卡那霉素抗性转化植株13株。PCR检测和Southern杂交结果表明,外源基因已经整合到马铃薯基因组中,其拷贝数1-3个不等。对转基因植株中StPUB基因的表达进行RT-PCR分析表明,StPUB基因在转基因植株中的表达量比对照显著降低,RNAi能有效的抑制StPUB基因的表达。从晚疫病病原菌离体接种结果发现,沉默StPUB的转基因株系,其病斑生长速率(LGR)比非转基因对照高,表明沉默StPUB基因降低了马铃薯的抗病性。转基因株系试管苗耐盐性试验结果表明,在盐胁迫条件下,沉默StPUB的转基因植株与野生型植株相比,地上部分和根系生长相对较弱,根部腐烂的株数明显增多,表明抑制.StPUB表达降低了马铃薯转基因株系的耐盐性。上述结果表明,StPUB在激活马铃薯抗晚疫病及耐盐反应中起作用。


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