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甘蓝型油菜S45AB隐性细胞核雄性不育表达谱的研究

陈玉宁  
【摘要】: 甘蓝型油菜细胞核雄性不育(GMS)败育彻底,不育性表现稳定,细胞质来源丰富,恢复源广泛,已成为我国油菜杂种优势利用的重要途径之一。甘蓝型油菜近等基因系(NIL) S45AB只在育性控制位点上Bnms1/BnMs1存在差异。以S45AB作为基础材料,利用半薄切片技术比较了S45AB花药的显微结构,利用差减文库和基因芯片技术分析了S45AB花蕾转录谱的表达差异,并通过差异表达基因的功能分析,推理了可能导致S45A花粉败育的代谢过程。主要结果如下: 半薄切片观察发现:在减数分裂前,不育材料S45A与可育材料S45B花药没有明显差异;至四分体时期,不育花药的绒毡层比可育花药的体积增大并排列紧密;在单核花粉期,S45A中小孢子没有花粉外壁的形成,小孢子切片呈光滑的圆形,发育长时间停留在小孢子单核期,同时,S45A中绒毡层继续恶化,液泡化明显,并最终解体。而在S45B中,由于小孢子表面外壁的存在,小孢子切片呈现出不规则四边形,小孢子发育为成熟的花粉粒。S45A败育发生的开始时期为四分体至小孢子单核期,绒毡层异常是引起败育的主要原因。 利用SSH构建了正向差减文库(富集了可育材料中上调表达的基因)和反向差减文库(富集了不育材料中上调表达的基因)两个文库,每个文库包含1536个克隆。对两个文库进行了反向Northern blot筛选,并且对正向文库的阳性克隆进行了测序,发现这些克隆代表了71个基因,其中有4条基因,分别为At1g30330, At1g71170, At5g10400, At5g52160在拟南芥花蕾中特异或相对大量表达。 利用Affymatrix公司的拟南芥寡核苷酸芯片,对S45AB花蕾之间的表达差异进行了分析,发现在S45B中有69条上调表达的基因,在S45A中有46条上调表达的基因。根据MIPS A. thaliana Genome Database提供的信息对这些基因,包括差减文库获得的和芯片筛选得的所有在S45B中上调表达的基因进行了功能归类。结果表明,这些基因可分为18大类,包括参与代谢、蛋白命运决定、蛋白结合功能、细胞转运、环境互作、亚细胞定位的相关基因和未知功能基因,分别占了28.60%、12.20%、36.80%、11.40%、13.10%、41.80%和17.20%,参与代谢调节的基因很少,只占1.63%。对25个在S45B上调表达的基因和5个在S45A中上调表达的基因进行了Real-time PCR验证,Real-time PCR结果证实芯片的结果真实可靠,并根据他们表达模式的差异,将在S45B中上调表达的23个基因分成三类,对第一类基因做了功能分析,发现4个基因,At3g06860、At3g51590、At4g00040和At5g48880参与了脂肪酸代谢途径,并且推测可能是绒毡层中脂肪酸代谢紊乱致使孢粉素合成受阻从而导致了S45A的小孢子败育。 根据Real-time PCR结果,比较了拟南芥花药发育的关键基因,A6, CALS5、DEX1、MYB103、MS1、MS2和NEF1在S45AB花蕾中的表达模式,比较了各拟南芥突变体的小孢子外壁缺失严重程度和发生的发育顺序及绒毡层外围组织的发育状况,提出了BnMs1基因在花药发育调控网络中的位置模型。


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