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《华中农业大学》 2010年
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猪粪好氧堆肥工艺及堆肥微生物的筛选、纯化与发酵的研究

武亮  
【摘要】: 堆肥是处理畜禽场废弃物的主要手段之一,这种处理方法具有投资小,效益高,可以使大量有机固体废弃物重复资源化利用等优点,但是同时也存在发酵周期长、堆肥产品质量不高等缺陷。为了提高堆肥产品的质量、缩短堆肥周期、提高堆肥效率,本试验主要从堆肥调理剂的选择、堆肥微生物菌种的筛选、筛选菌株的功能及对堆肥中微生物群落的影响等方面开展了研究,试验结果总结如下: 1.不同调理剂对猪粪好氧堆肥过程的影响 分别以锯末、米糠和木屑为调理剂,调节堆肥原料的碳氮比为25:1,含水率为60%,通风方式采用人工翻堆的方式进行猪粪好氧堆肥。从各调理剂堆肥的温度、含水率、pH值、有机碳含量、发芽指数、全氮含量及碳氮比等方面进行了比较。3个堆体都经历了快速升温期、持续高温期和缓慢降温期3个时期,均可以实现好氧堆肥的腐熟,并使堆肥产品达到国家粪便无害化卫生标准。不同的调理剂对猪粪好氧堆肥堆体的温度变化影响较大,其中,以锯末为调理剂的堆体升温最快,米糠次之,木屑升温最慢。以米糠为调理剂的堆体的高温期最长,锯末次之,木屑的高温期最短。3个堆体含水率的变化趋势相同,都随着堆肥的进程而不断降低,都从开始的60%左右降低到33%左右。使用3种不同调理剂进行猪粪好氧堆肥的最终产品中氮元素的相对含量差异显著(P0.05),以锯末和米糠为调理剂的堆肥产品的全氮含量较高,为2.12%和2.10%,以木屑为调理剂的堆肥产品的的全氮含量较低,为1.90%。 2.堆肥中产葡聚糖内切酶微生物的筛选、分离与纯化 通过以CMC-Na为唯一碳源的筛选培养基进行初筛得到17株不同的微生物,经滤纸培养基进行复筛后得到一株能够产CMC酶的菌株。经形态学鉴定发现,该菌株为产芽孢的革兰氏阳性菌,并通过细菌16S rDNA的通用引物对该菌株的16SrDNA扩增测序,与NCBI数据库中的序列比对后发现,该菌株的16SrDNA序列与枯草芽孢杆菌的16SrDNA序列相似度达到100%,因此该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌,命名为Subtilis bacillus dcy-1,并保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为:CCTCC M208122。分离菌株的最佳液体产酶培养基为:麸皮1.5%,豆粕1.5%,NaCl 0.5%, CaCl2 0.05%, MgSO4 0.05%,酵母提取物0.1%;产酶条件为:发酵温度为30℃,培养基初始pH值为7.0,培养时间为40h时CMC酶活达到最大。菌株所产的CMC酶的最佳作用温度为55℃,最佳pH值为7.5,Na+、Ca2+、Ni2+对CMC酶酶促反应有一定的促进作用,Cu2+和Mn2+对CMC酶酶促反应有显著的抑制作用。CMC酶在低于60℃时热稳定性较好,在pH值为5-8时比较稳定。 3.分离并鉴定了枯草芽孢杆菌Subtilis Bacillus-dcyl的Egl基因 通过设计引物获得了完整的CDS序列,GenBank数据库登陆号为,HM036060,通过生物信息学分析软件对基因的结构和性质进行了预测。以枯草芽孢杆菌为出发菌株,构建了枯草芽孢杆菌Egl基因重组原核表达载体pGEX-KG,优化后的最佳条件为IPTG诱导3.5h,其浓度为0.6mmol/L,主要以可溶的形式存在,通过对表达产物活性的测定发现,葡聚糖内切酶活性可达121.23U/ml。 4.堆肥中微生物总DNA提取方法的改进研究 针对堆肥中微生物抗性比较强的特点,设计了通过蛋白酶和蜗牛酶2次消化的堆肥样品的DNA提取方法。分别从对微生物细胞的裂解效率、DNA产量、DNA回收效率及PCR可扩增性等方面对3种不同的DNA提取方法进行了研究比较,结果表明,3种方法都能够从堆肥样品中成功的提取出微生物的DNA,但是,双酶裂解法比其他2种方法效率更高,更加经济实用。本试验中所提出和改进DNA提取方法可以有效的应用于堆肥样品中,由于堆肥样品中的杂质和干扰物要比土壤、污水等环境样品中更加复杂一些,所以,这种方法也可以应用于其他环境样品微生物的提取与纯化。 5.添加外源微生物对堆肥细菌群落的影响 堆体接种外源微生物后能够明显的提高堆体的温度升高速度和堆体的最高温度,延长了高温期的时间。通过RFLP技术快速、准确地研究了猪粪好氧堆肥过程中不同时期的细菌群落的变化。比较了接种外源微生物的堆体和自然堆肥堆体中细菌种类和数量的差异,结果表明接种外源微生物可以改变堆肥中微生物群落的变化,所接种的微生物能够适应堆肥的环境,并成为优势菌群。通过与NCBI数据库中比较,试验中共发现35条序列与已知微生物序列相似性很低,这些序列有可能是堆肥中尚未发现的新物种,它们在堆肥中的作用有待进行进一步研究。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S141.4

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