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《华中农业大学》 2010年
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甘蓝型油菜矮杆基因Bnrga-ds的克隆和功能分析

刘超  
【摘要】: 株高是油菜重要的农艺性状。适度矮化的油菜品种不仅抗倒伏性增强,而且更适合于机械化收获。筛选株高适度和农艺性状优良的矮杆突变体是培育矮杆品种的关键。与水稻和小麦相比,油菜矮杆突变体数量较少,而且仅有白菜突变体dwf2的矮杆基因被克隆,矮化机理被揭示。因此,进一步发掘具有生产应用价值的矮杆资源并克隆相应的矮杆基因将有助于油菜的矮化育种。ds-1是一个通过EMS诱变小孢子获得的甘蓝型油菜半矮杆突变体。本研究以ds-1为研究材料,定位和克隆了矮杆基因ds-1并对其进行了功能分析,探讨了ds-1矮杆性状形成的机理,为矮杆基因ds-1在矮化育种中的应用提供了理论基础。同时本研究还获得与ds-I基因紧密连锁的分子标记,将有利于ds-1基因的分子标记辅助选择育种。另外,ds-I基因也被用于甘蓝型油菜的转基因育种。主要结果如下: 1.ds-1和高秆品种No.9369的F1株高介于两个亲本之间,F2群体的株高呈三峰连续性分布。对F3家系的分析结果表明,F2群体中纯合矮杆、中间型和纯合高杆植株符合1:2:1的分离比例,表明ds-1矮杆性状受单个部分显性基因控制。 2.筛选获得了3个与DS-I基因连锁的SSR标记BnEMS1125、BrGMS83和BrMS226,它们位于甘蓝型油菜A6染色体,其中BnEMS1125与DS-I基因共分离。BnEMS1125是根据甘蓝型油菜BnRGA编码序列开发的标记,RGA的突变在拟南芥等物种中造成了矮杆表型。因此我们将BnRGA作为DS-I的候选基因。SCAR标记SCM07是甘蓝型油菜矮杆基因Bzh紧密连锁的标记。本研究显示SCM07与DS-I基因连锁,遗传距离为0.7cM,表明Bzh与DS-1可能是等位基因。 3. RT-PCR结果显示No.9369和ds-1的BnRGA(分别命名为BnRGA和Bnrga-ds)表达没有显著差异,表明矮化突变位点没有发生在BnRGA的启动子区域。将ds-1与No.9369和12个甘蓝型油菜常规品种的BnRGA基因的编码序列进行比对,发现Bnrga-ds蛋白VHYNP模体中保守的脯氨酸(Pro)突变为亮氨酸(Leu)可能造成了ds-1的矮化表型。 4.将BnRGA和Bnrga-ds分别转化野生型拟南芥,Bnrga-ds转基因植株高度比野生型明显降低,BnRGA转基因植株没有出现矮杆表型,进一步表明Bnrga-ds是控制ds-1矮化性状的基因。 5.用定点突变的方法在拟南芥AtRGA蛋白中产生与Bnrga-ds相同的点突变,即VHYNP模体中保守的Pro突变为Leu,并将突变基因Atrga-ds转化拟南芥,T2代植株出现明显的矮杆表型,表明Pro的突变造成了ds-1的矮化表型,并且该突变造成的矮化效应在不同物种中是保守的。 6.酵母双杂交结果表明,在GA3存在的条件下,拟南芥GA受体AtGID1a可以和野生型BnRGA和AtRGA相互作用,和突变形式的Bnrga-ds和Atrga-ds没有相互作用。表明VHYNP模体中保守的Pro是GID1和RGA相互作用的重要位点。 7.亚细胞定位结果显示, BnRGA和Bnrga-ds蛋白定位于植物细胞的细胞核中,表明BnRGA和Bnrga-ds可能行使转录调节因子的功能。 8.将Bnrga-ds通过农杆菌介导的方法转化甘蓝型油菜品种Westar,共获得14株阳性转基因植株,部分To植株出现矮杆表型,T1植株的表型将做进一步鉴定。
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