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《华中农业大学》 2010年
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单一田块核盘菌多样性分析及携带真菌病毒的菌株的遗传特性研究

张丽艳  
【摘要】: 核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary)是一种世界性分布的重要病原菌,能够侵染75科450多种植物,常见的重要寄主包括油菜、大豆、向日葵等油料作物和多种蔬菜作物。以油菜为例,由核盘菌引起的菌核病是油菜上的首要病害,一般发病率为10-30%,严重达80%以上,严重影响油菜的产量以及品质。高效、安全的防控措施研究一直是菌核病研究重点。利用致病力衰退相关病毒控制真菌病害是一种重要的生物防治途径。包括核盘菌在内,目前已在很多真菌中发现有致病力衰退相关的真菌病毒,但是所发现的种类极其有限。本论文研究旨在从核盘菌中寻找和鉴定更多的真菌病毒,并研究这些病毒对寄主的影响。 从湖北省孝感市郊区同一油菜田(面积约666 m2)的不同发病植株的茎秆病斑上成功分离获得了83株核盘菌菌株,通过对菌丝生长速度、菌丝干重、菌核大小及数量、菌落形态、和致病力等生物学特性进行研究,发现它们在菌落形态、生长速率和致病力等方面存在显著的多样性。经过对其中的30个菌株进行群体菌丝融合群(MCG)的鉴定分析,发现这30个菌株可划分为17个菌丝融合群。其中9个菌丝融合群只包含一个菌株,它们只与自身可进行营养亲和,其余的MCGs包含2至5个菌株。研究还发现,有些菌株尽管来自同一茎秆,它们也会出现菌丝体不融合现象,造成对同一茎秆的复合侵染。这些结果表明即使在很小的范围内,核盘菌也存在复杂的多样性。 在这83株菌株中,发现XG36-1菌株与其它菌株在表型上存在显著的差异。这些差异包括XG36-1菌株生长缓慢、菌落呈扇型扩展、气生菌丝发达、产生菌核数量较少且不规则排列于菌落中;在致病力方面,XG36-1菌株几乎不能在离体油菜叶片上形成病斑,致病力极其微弱。XG36-1菌株的表型与实验室早期报道的病毒性弱毒菌株Ep-1pN的类似,是一株弱毒的衰退菌株。为了明确XG36-1菌株的衰退机理,对该菌株进行了以下的研究:(1)XG36-1菌株的原生质体再生子代生物学特性分析;(2)XG36-1菌株子囊孢子后代的生物学特性分析;(3)XG36-1菌株衰退特性的传染性试验;(4)对XG36-1菌株的细胞进行电子显微观测及病毒粒体的分离;(5)病毒性核酸分离和鉴定分析。发现XG36-1菌株的原生质体再生后代按表型可以分为三种类型,即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型等,其中约有25.5%的再生植株属于Ⅰ型,约23.8%的再生植株属于Ⅱ型,Ⅲ型再生植株与弱毒菌株XG36-1并没有显着差异,分离频率为51.7%。共获得了104个子囊孢子单孢分离物,它们均具有正常菌株的表型,而与XG36-1菌株有显著的差异。表明XG36-1菌株具有正常菌株的细胞核遗传物质,其衰退系由非染色体遗传物质所致,而且在细胞中分布不均匀。利用农杆菌介导技术转化了核盘菌正常菌株XG36-1A34,筛选并获得具正常表型且抗潮霉素的转化子XG36-1A34R。将XG36-1菌株与XG36-1A34R进行对峙培养,可以自含有潮霉素的PDA平皿中分离到具有XG36-1菌株表型的分离物,表明XG36-1菌株中与衰退相关的遗传因子是可以移动的,具有传染特性。透射电镜显微观测发现XG36-1菌株中的菌丝细胞中存在直径约为40 nm的类似病毒粒体(VLP), XG36-1菌株的子囊孢子单孢分离物的菌丝细胞中没有发现VLP,一旦与XG36-1菌株接触后,将获得出现类似的VLP。采用蔗糖梯度离心的方法可以自XG36-1菌株的菌丝体中分离到少量的VLP。采用纤维素CF-11吸附法自菌丝体中和自纯化的病毒粒体中都没有成功地分离到病毒的核酸。 而在这83株菌株中也发现一株XG19-2菌株,它在生长、菌落形态、菌核形成和致病等方面与核盘菌正常菌株没有显著差异。但是,采用CF-11吸附法自其菌丝中提取和分离到大小约为4kb左右的dsRNA片段。利用随机引物对该dsRNA片段进行了cDNA克隆。获得了2个阳性克隆,将近700多bp,通过测序和序列分析,发现这两个阳性克隆均含有一个不完整的阅读框。将其推定的编码的肽链进行Blastp分析,发现这两个肽链均与真菌病毒Diaporthe ambigua RNA virus 1 (DaRVl)的依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)具有较高的同源性。表明XG19-2菌株中的dsRNA实质上是一种未知真菌病毒的基因组,命名这种病毒为核盘菌XG19-2 RNA病毒(Sclerotinia sclerotiorum XG19-2 RNA virus, SsXG19-2RV)。 本研究证实即使在面积相对较小的油菜田间核盘菌也具有丰富的多样性;分离获得了弱毒菌株XG36-1,并证实其衰退与感染未知的真菌病毒紧密相关,而且存在于菌株XG36-1病毒粒体较少,但是可以使其致病力严重衰退,所以在评估其作为生防因子的价值中有着非常重要的意义。在正常表型的菌株XG19-2中分离和鉴定出一种与DARV1具有显著亲缘关系的新病毒。而Diaporthe ambigua RNA virus 1是可以使洋梨干枯病病原菌毒力衰退,但是XG19-2中SsXG19-2RV病毒并没有对寄主产生影响,这不仅表明虽然同种真菌病毒可以在多种寄主中存在,而且在和不同的寄主互作方式也不同,所以研究SsXG19-2RV可以更进一步了解病毒与寄主之间的关系,而且对深入认识核盘菌及其菌核病的安全控制具有较重要的理论意义和实践价值,同时也丰富了真菌病毒理论体系。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S432.44

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【引证文献】
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5 李华;核盘菌受真菌病毒抑制的基因的鉴定和分析[D];华中农业大学;2005年
6 滕飞;核盘菌弱毒相关RNA病毒(SsDRV)感染雪腐核盘菌的初步研究[D];华中农业大学;2008年
7 卫冬妹;核盘菌弱毒相关病毒基因组分子生物学特性的初步研究[D];华中农业大学;2003年
8 周浩;盾壳霉CmRV基因组的全长cDNA克隆及转化ZS-1的研究[D];华中农业大学;2007年
9 唐清;盾壳霉ZS-1菌株对核盘菌弱毒株Ep-1PN影响的初步研究[D];华中农业大学;2009年
10 肖奎;四川食用菌病毒dsRNA的检测和对多菌灵的敏感性测定[D];四川农业大学;2008年
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