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《湖北中医药大学》 2011年
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辛温通阳中药葱白提取物对动脉粥样硬化大鼠IL-6/STAT3信号通路的调节作用及机制研究

郝建军  
【摘要】:目的 通过辛温通阳中药和活血化瘀中药、化痰中药、通络中药、通下中药治疗动脉粥样硬化的对比研究,探讨辛温通阳中药葱白提取物对动脉粥样硬化大鼠IL-6/STAT3信号通路的调节作用及机制研究,初步揭示辛温通阳中药治疗AS的生物学基础。 方法 本研究选用健康纯种SD雄性大白鼠,体重为200-230克,3-4月龄120只,随机分为正常对照组、空白模型组、葱白提取物组、薤白提取物组、桂枝提取物组、干姜提取物组、附子提取物组、丹参提取物组、瓜蒌提取物组、地鳖虫提取物组、大黄提取物组、普罗布考组,每组10只。参照郭延松等的方法制备动脉粥样硬化模型。适应性喂养一周后,正常对照组喂基础饲料和普通自来水,模型组及各治疗组以高脂饲料(2%胆固醇、0.5%胆酸钠、3%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶和94.3%的基础饲料)和维生素D3粉剂(1.25×106u/kg)喂养。并于实验开始时于右下肢肌肉注射维生素D3针剂(3×105u/kg体重),以后每隔30天重复注射一次。于第7天除正常对照组外,其余各组行大鼠主动脉内膜球囊损伤术 于造模后第3天开始给药,给药体积为2ml/kg,正常对照组和空白模型组给予生理盐水。葱白提取物组按20mg·kg-1给药、薤白提取物按20mg·kg-1给药、桂枝提取物按15mg·kg-1给药、干姜提取物按10mg·kg-1给药、附子提取物按20mg·kg-1给药、丹参提取物按10mg·kg-1给药、瓜蒌提取物按10mg·kg-1给药、地鳖虫提取物按10mg·kg-1给药、大黄提取物按10mg·kg-1给药、普罗布考组按10mg·kg-1给药;每日1次,连续给药16周。 于实验16周末禁食16h后,麻醉动物,腹主动脉取血后,分离颈总动脉,在主动脉弓起始段取0.5cm主动脉标本,10%多聚甲醛溶液固定12小时;打开腹腔,分离血管外脂肪组织,沿主动脉背部正中线剪开,生理盐水冲洗,-80℃低温冰箱保存备用;取血5ml留置2管,分别分离血清,保存在-80℃低温冰箱备用。 通过HE染色、油红O染色分析病理变化和脂质沉积情况;用实时荧光定量PCR技术、Western Blot检测TLR4、LXR在AS大鼠腹主动脉中的表达;免疫组化法检测JNK/P-JNK、P38MAPK/p-p38 MAPK在AS大鼠腹主动脉中的表达,用ELISA法检测ERK1/2/P-ERK1/2的表达,用Western Blot检测P38MAPK/p-p38 MAPK在AS大鼠腹主动脉中的表达;用实时荧光定量PCR技术检测AS大鼠腹主动脉血管AGTR1mRNA的表达;采用免疫组化法、Western Blot检测AS大鼠腹主动脉NFκB P65/p-NFκB P65的表达;用ELISA法、免疫组化法、实时荧光定量PCR技术检测AS大鼠腹主动脉血管IL-6的表达;Western Blot检测AS大鼠腹主动脉JAK1/p-JAK1、STAT3/p-STAT3的表达。 结果 1.对AS大鼠动脉血管壁组织形态的影响将主动脉标本用70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水,二甲苯透明,蜡块包埋,制成石蜡切片(5μm)、HE染色,观察动脉管壁形态学变化。 HE染色结果提示,空白模型组大鼠血管中膜及外膜分界不清,中膜增生明显,内膜增厚,不光滑,内皮细胞损伤脱落且连续缺失,可见斑块突出管腔,斑块内含有大量的巨噬细胞,平滑肌细胞和胶原含量相对较少;葱白提取物组内膜增厚程度相对较轻,内皮细胞排列较整齐,弹力膜连续无断裂,斑块亦无破裂;薤白提取物组中膜增生相对较轻,内皮细胞排列相对整齐,弹力膜可见断裂,亦见斑块破裂;附子提取物组、丹参提取物组和地鳖虫提取物组见胶原增生明显,中膜增厚,结构不清晰,丹参组相对较轻;桂枝提取物组见内膜增厚,不光滑,内皮细胞损伤脱落;干姜提取物组外膜明显增厚,结构不清晰,内皮细胞损伤脱落,斑块破裂;瓜蒌提取物组中膜增生明显,内膜不光滑,内皮细胞损伤脱落,见炎性浸润;大黄提取物组增生不明显,内膜相对光滑,内皮细胞完整,平滑肌细胞排列整齐;普罗布考组增生不明显,内膜光滑,内皮细胞完整且没有破损,但见少许胶原增生。 将固定的腹主动脉标本用蒸馏水冲洗后,‘用油红0染色,分析组织切片中的中性甘油三脂,脂质以及脂蛋白等脂质状况。 油红0进行染色结果显示,模型大鼠腹主动脉血管壁有大量的脂质沉积,血管壁脂肪含量显著增加。普罗布考组早期干预治疗具有明显的降脂作用,脂质沉积最少。和其它干预组比较,通阳中药葱白提取物组和薤白提取物组血管壁中脂质沉积也明显减少,葱白提取物组减少更明显。化痰中药瓜蒌提取物组有大量脂质沉积。 2.TLR4、LXR在AS大鼠腹主动脉中的表达正常对照组比较空白模型组大鼠腹主动脉TLR4蛋白水平显著升高;与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可降低TLR4蛋白水平,各干预组抑制率分别为:干姜提取物组为73.11%、大黄提取物组为71.77%、地鳖虫提取物组为71.29%、普罗布考组为68.56%、桂枝提取物组为54.03%、瓜蒌提取物组为49.70%、附子提取物组为49.11%、葱白提取物组为48.38%、丹参提取物组为47.31%、薤白提取物组为40.19%。 与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉TLR4mRNA显著升高,扩增倍数为57.27;与空白模型大鼠组比较,各干预组TLR4mRNA表达均有降低,各组基因扩增倍数的变化为:桂枝提取物组为0.42、地鳖虫提取物组为0.96、瓜蒌提取物组为4.03、丹参提取物组为5.97、普罗布考组为6.68、薤白提取物组为7.28、干姜提取物组为10.31、附子提取物组为16.98、葱白提取物组为37.33、大黄提取物组为52.81。 与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉LXR蛋白显著降低;与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可升高LXR蛋白水平,各干预组增长率分别为:地鳖虫提取物组为212.64%、瓜蒌提取物组为205.73%、薤白提取物组为187.90%、干姜提取物组为147.31%、桂枝提取物组为136.91%、丹参提取物组为94.00%、附子提取物组为92.83%、葱白提取物组为67.60%、大黄提取物组为55.92%、普罗布考组为42.36%。 与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉LXRmRNA明显降低,扩增倍数为1.00;与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可升高LXRmRNA水平,各干预组增长率分别为:薤白提取物组为11.12、葱白提取物组为9.40、地鳖虫提取物组为7.16、干姜提取物组为2.11、丹参提取物组为1.52、普罗布考组为1.22、桂枝提取物组为0.81、瓜蒌提取物组为0.69、大黄提取物组为0.56、附子提取物组为0.47。 3.对AS大鼠腹主动脉JNK/P-JNK、ERK1/2/P-ERK1/2、P38MAP K/p-p38MAPK表达的影响磷酸化前,与正常对照组比较,空白模型组大鼠腹主动脉JNK表达显著增高,各干预组对JNK的抑制率分别为:瓜蒌提取物组为77%、干姜提取物组为74%、附子提取物组为74%、薤白提取物组为72%、桂枝提取物组为64%、地鳖虫提取物组为65%、葱白提取物组为63%、大黄提取物组为55.92%、丹参提取物组为51%、普罗布考组为42.36%;磷酸后,与正常对照组比较,空白模型组大鼠腹主动脉P-JNK表达显著增高;与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可降低P-JNK水平,各干预组抑制率分别为:瓜蒌提取物组为82.30%、大黄提取物组为71.92%、桂枝提取物组为71.78%、附子提取物组为70.09%、普罗布考组为67.91%、薤白提取物组为67.77%、丹参提取物组为67.71%、葱白提取物组为67.37%、干姜提取物组为66.63%、地鳖虫提取物组60.11%。 磷酸化前,与正常对照组比较,空白模型组大鼠血清ERK1/2表达显著增高,各干预组对ERK1/2的抑制率分别为:地鳖虫提取物组46.47%、附子提取物组为40.70%、干姜提取物组为37.86%、瓜蒌提取物组为32.05%、丹参提取物组为28.41%、大黄提取物组为27.50%、薤白提取物组为25.62%、桂枝提取物组为24.47%、葱白提取物组为13.29%、普罗布考组为12.70%;磷酸后,与正常对照组比较,空白模型组大鼠腹主动脉P-ERK1/2表达显著增高;、与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可降低P-ERK1/2水平,各干预组抑制率分别为:丹参提取物组为83.53%、附子提取物组为76.91%、大黄提取物组为73.09%、瓜蒌提取物组为65.46%、地鳖虫提取物组59.64%、桂枝提取物组为59.44%、薤白提取物组为53.62%、干姜提取物组为46.98%、葱白提取物组为42.57%、普罗布考组为34.54%。 磷酸化前,与正常对照组比较,空白模型组大鼠血清P38MAPK表达显著增高,各干预组对P38MAPK的抑制率分别为:地鳖虫提取物组46.47%、附子提取物组为40.70%、干姜提取物组为37.86%、瓜蒌提取物组为32.05%、丹参提取物组为28.41%、大黄提取物组为27.50%、薤白提取物组为25.62%、桂枝提取物组为24.47%、葱白提取物组为13.29%、普罗布考组为12.70%;磷酸后,与正常对照组比较,空白模型组大鼠腹主动脉p-p38MAPK表达显著增高;与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可降低p-p38MAPK水平,各干预组抑制率分别为:附子提取物组为82%、干姜提取物组为78%、普罗布考组为76%、桂枝提取物组为68%、大黄提取物组为67%、丹参提取物组为43%、地鳖虫提取物组40%、薤白提取物组为25%、瓜蒌提取物组为27%、葱白提取物组为17%。 4、对AS大鼠腹主动脉AGTR1表达的影响与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉AGTR1mRNA表达显著升高;与空白模型大鼠组比较,各治疗组均可升高AGTR1mRNA水平,各干预组扩增倍数分别为:薤白提取物组为11.12、葱白提取物组为9.40、地鳖虫提取物组7.16、干姜提取物组为2.11、丹参提取物组为1.52、普罗布考组为1.22、桂枝提取物组为0.81、瓜蒌提取物组为0.69、大黄提取物组为0.56、附子提取物组为0.47。 5.对AS大鼠腹主动脉NFκBP65/p-NFκB表达的影响与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉p-NFκB P65表达明显增高(P0.01),干预治疗后,各给药组均可以降低p-NFκBP65磷酸化程度。组间比较,普罗布考组作用最好,通下中药大黄提取物组次之,其余各组抑制磷酸化的作用依次是活血化瘀中药丹参提取物、通络中药地鳖虫提取物、通阳中药葱白提取物、通阳中药薤白提取物、化痰中药瓜蒌提取物、通阳中药桂枝提取物和通阳中药附子提取物。 与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉p-NFκBP65含量显著降低(P0.05);与空白模型组比较,通阳中药葱白提取物和薤白提取物磷酸化程度升高,普罗布考组、通下中药大黄提取物和化痰中药瓜蒌可以明显降低磷酸化水平,通阳中药干姜提取物和桂枝提取物次之,通阳中药附子提取物和活血化瘀中药丹参提取物无明显改善。 6.对AS大鼠IL-6表达的影响与正常对照组比较,模型组大鼠IL-6值明显升高(P0.01);与空白模型组比较,通阳中药葱白提取物、桂枝提取物组、干姜提取物组、薤白提取物组、通下中药大黄提取物组和普罗布考组IL-6水平明显降低(P0.01),活血化瘀中药丹参提取物组、通阳中药附子提取物、化痰中药瓜蒌提取物和通络中药地鳖虫提取物组均没有显著差异(P0.05),其余各组均有明显降低,具有统计学意义(P0.01);和大黄提取物组比较,没有显著差异(P0.05)。 空白模型大鼠腹主动脉血管IL-6的表达明显升高;与空白模型组比较,各治疗组均可降低IL-6的水平(P0.01);通络中药地鳖虫提取物降低最为显著,其余各组依次为:化痰中药瓜蒌提取物、通阳中药附子提取物、通阳中药薤白提取物、活血化瘀中药丹参提取物、通阳中药葱白提取物、通阳中药干姜提取物、普罗布考、通阳中药桂枝提取物;普罗布考作用和通阳中药桂枝提取物没有显著差异。 空白模型大鼠腹主动脉血管IL-6mRNA的表达明显升高;与模型组比较,各治疗组均可降低IL-6的水平(P0.05,P0.01);化痰中药瓜蒌提取物和通下中药大黄提取物作用最明显,其余各组依次排序为:通阳中药干姜提取物、通阳中药附子提取物、通阳中药葱白提取物、普罗布考。 7.对AS大鼠腹主动脉JAK1/p-JAK1、STAT3/p-STAT3表达的影响与正常对照组比较,空白模型组大鼠腹主动脉p-JAK1水平显著提高(P0.01);与空白模型组比较,各干预治疗组均可显著降低p-JAK1水平,其中通阳中药干姜提取物组效果最好,其余各组的作用依次是:通阳中药干姜提取物组、通阳中药薤白提取物组、通下中药大黄提取物组、活血化瘀中药丹参提取物组、普罗布考组、通阳中药桂枝提取物组、化痰中药瓜蒌提取物组、通络中药地鳖虫提取物组、通阳中药葱白提取物组。 与正常对照组比较,模型组大鼠腹主动脉p-STAT3水平明显降低(P0.01);与空白模型组比较,通阳中药葱白提取物p-STAT3水平明显升高,其他各组升高p-STAT3的作用依次为,通阳中药薤白提取物次之,活血化瘀中药丹参提取物、化痰中药瓜蒌提取物、通络中药地鳖虫提取物、通下中药大黄提取物作用相当,通阳中药桂枝提取物作用最小。 结论 1.辛温通阳中药葱白防治AS的炎症免疫机制主要与激活AngⅡ及受体AGTR1mRNA表达,影响JAK2/STAT3信号转导通路有关。 2.辛温通阳中药葱白防治AS的非炎症免疫机制主要通过降低TLR4及TLR4mRNA的水平,升高LXR及LXRmRNA,维持二者之间的平衡,抑制MAPKS家族亚族的JNK、p38MAPK、ERK1/2的磷酸化,作用于和转录因子NFκB,引起瀑布式反应,促进炎症因子IL-6的分泌,影响JAK2/STAT3信号转导通路。 3.辛温通阳中药葱白提取物、薤白提取物、桂枝提取物、干姜提取物、附子提取物,活血化瘀中药丹参提取物,化痰中药瓜蒌提取物,通络中药地鳖虫提取物和通下中药大黄提取物均可以影响IL-6/STAT3信号通路中相关的细胞因子的表达,具有防治AS的作用。但是由于作用环节和作用靶点的不同,药物成分的复杂性,对其整体优势的评价还有待进一步深入研究。 4.中药性味功效之间的关系对药物的药效及机制的影响各不相同,在多个方面发现一些有价值的现象,具有很好的研究价值,其机制有待于进一步深入研究。
【学位授予单位】:湖北中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285.5

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7 李春艳;曾艳波;彭芳;戴好富;郑永唐;;蒲葵籽提取物体外抗HIV-1活性及机制的初步研究(论文摘要)[A];中华中医药学会防治艾滋病分会第六届学术年会论文汇编[C];2008年
8 卢汝梅;李兵;苏醒;钟振国;张雯艳;;紫玉盘提取物体外抗肿瘤活性的实验研究[A];第二届临床中药学学术研讨会论文集[C];2009年
9 林青;;天麻提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[A];中华中医药学会血栓病分会第四次学术研讨会暨广东省中医药学会血栓病专业委员会首届学术研讨会论文集[C];2010年
10 韩伟娟;尹大力;;冬虫夏草提取物ISP-Ⅰ的类似物的合成[A];中国化学会第八届天然有机化学学术研讨会论文集[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 刘云涛;牛蒡子提取物可改善糖尿病肾损害[N];医药导报;2006年
2 张中桥;银杏叶提取物能保护中脑原代细胞[N];中国医药报;2005年
3 ;花椰菜苗提取物有助皮肤防紫外线伤害[N];人民日报;2007年
4 董国用;天然产物提取物着手定“标”[N];农民日报;2005年
5 辛华;未来的绿色食品添加剂——海鲜提取物[N];中国食品质量报;2004年
6 言实;我国药用植物提取物出口市场广阔[N];中国医药报;2001年
7 中信;药用植物提取物出口前景广阔[N];中国中医药报;2001年
8 仲海亮;葡萄提取物可消除大肠杆菌耐药[N];中国医药报;2006年
9 申花;日本利用芥末提取物开发生产抗菌保鲜功能性薄膜[N];中国包装报;2006年
10 张中朋 刘张林;植物提取物产品出口增长持续 增幅回落[N];中国医药报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郝建军;辛温通阳中药葱白提取物对动脉粥样硬化大鼠IL-6/STAT3信号通路的调节作用及机制研究[D];湖北中医药大学;2011年
2 陈承杰;马齿苋提取物抗缺氧作用及其机制的研究[D];第二军医大学;2010年
3 邢雁伟;辨证与辨病结合的清热、活血、益气药抑制心脏早搏的电生理实验研究[D];北京中医药大学;2005年
4 储全根;加味桃核承气汤及其不同提取物对糖尿病大鼠心肌和主动脉病变的影响[D];广州中医药大学;2005年
5 于飞;薏苡仁提取物抗肿瘤新靶点及降血脂抗氧化活性研究[D];天津大学;2010年
6 殷丹;江南卷柏提取物抗柯萨奇病毒和单纯疱疹病毒的研究[D];湖北中医学院;2009年
7 贾娜;黑加仑提取物的抗氧化活性与应用及其对胃癌细胞增殖的抑制作用[D];东北农业大学;2012年
8 吴丽莎;虾过敏原提取物量效关系的表征[D];中国海洋大学;2012年
9 靳利娥;酶类与非酶类天然提取物抗氧化性研究[D];太原理工大学;2010年
10 姚楠;欧洲越橘提取物抗眼组织氧化应激的作用研究[D];暨南大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 包春荣;荔枝核提取物对T2DM大鼠认知障碍的调控[D];泸州医学院;2010年
2 梁均乐;知母提取物药时曲线测定及大鼠肠道菌代谢研究[D];华南理工大学;2010年
3 朱培庆;黄连麦冬提取物对体外培养大鼠结膜杯状细胞增殖作用及有效成分配伍筛选的实验研究[D];成都中医药大学;2011年
4 迟克强;孕酮及石菖蒲提取物对发育期大鼠反复惊厥后大脑皮质γ-氨基丁酸A受体α1亚单位表达的影响[D];中南大学;2010年
5 黄翠丽;扇贝裙边提取物抗动脉粥样硬化作用及其对血管平滑肌细胞增殖的影响[D];青岛大学;2001年
6 李强;附子提取物诱导T淋巴细胞白血病细胞株CEM凋亡的实验研究[D];成都中医药大学;2004年
7 刘杰;复方GGV兔体内药动学初步研究[D];重庆大学;2004年
8 丁小静;蓝莓提取物对急性化学性肝损伤的干预作用[D];吉林大学;2010年
9 魏艳丽;乳化型香肠中脂肪氧化及控制的研究[D];天津商业大学;2010年
10 姜伟伟;黑米皮提取物对PC-3细胞增殖的影响及机制研究[D];中南大学;2010年
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