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《湖北中医药大学》 2017年
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纳米传感针的研制及其对生物活性分子和中药调控一氧化氮释放监测的研究

唐丽娜  
【摘要】:研究背景和目的传统中医药以其整体治疗及其独特的科学理论而著称于世。中医药在各类疾病的病因病机及治疗上均积累了丰富的经验,但对其作用机制还有待深入研究。依据中医药理论,针对不同症候,运用不同复方,可使模型动物全脑或着不同脑区神经递质及其代谢产物的水平发生变化。虽然这些变化在程度、性质以及作用机理上均存在差异,但说明中医药对调节神经递质及其代谢具有重要的作用。同样,针灸是中医学的重要组成部分,根源于中国,也有着悠久的历史。与药物的直接干预不同,针灸可能是通过激发机体的潜能,启动内在的多种调控机制间接参与作用。针灸作用于穴位,人体穴位与经脉的三维结构处会发生分子事件。因此,研制测定穴位区神经递质水平和分子事件的传感针,对阐明中药和针灸的治病机理意义重大。传感针是以中医针灸针为基体,应用多种现代技术加工制备,赋予了其感知人体微区中的pH值、氧分压、温度、组织胺、钙离子等信息变化的功能,具有中国特色。关于传感针的较早研究多是在传感的表面涂覆高分子敏感膜用于监测信号分子。然而高分子敏感膜修饰层是通过物理吸附到传感针表面的,结合不牢固,且敏感膜厚度并不均匀,影响信号传输。最重要的一点是针刺入体内,高分子敏感膜易脱落。而且此传感表面粗糙,结构不稳,很难实现检测的稳定性。所以需要研制一种更为牢固,灵敏度高,性能足够稳定的传感针。纳米材料具有多个优点:例如比表面积大、催化效率高、吸附能力强、表面活性位点多等。近些年来利用纳米材料特殊性质,研究者将其引入传感器的设计中,目的是提高传感器的灵敏度和特异性。其中,纳米材料石墨烯因其具有大的比表面积、高导电性、较强的吸附性能和较快的电子传递速度及优良的电催化活性等相关优势,成为了制备各类传感器的理想材料,在发展新型储能材料、生物器件设计、生物分子检测、生化分析和分子医疗诊断等多方面得到了广泛的研究与重视。本研究拟将纳米技术与传统针灸针结合,制备新型纳米材料功能化的传感针,用于生物活性分子如多巴胺(DA)、一氧化氮(NO)的检测及中药调控NO释放监测的研究。用此纳米传感针实时在体监测体内重要生物活性分子,既可以反映中药调节神经递质作用,又可以探究针灸作用于人体穴位过程中产生的活性分子量的变化,为探讨中药或针灸治病机理提供理论和技术支持。方法与结果运用电化学方法制备石墨烯或功能化石墨烯修饰的针灸传感针,用该纳米传感针实现了对pH、DA的电化学检测和大鼠穴位处NO的实时监测。在此基础之上,应用纳米传感针对四种中药活性成分调控NO释放进行实时监测研究。本课题的主要内容包括以下三个部分:第一部分:纳米传感针的研制及其用于检测神经递质多巴胺首先用改进的Hummers方法合成水溶性的氧化石墨烯(Go),采用拉曼光谱法对Go进行表征;然后利用电化学循环伏安一步沉积法将Go还原修饰至针灸针的尖端,得到电化学还原的石墨烯(ERGO)修饰的传感针(G-AN),并采用电化学循环伏安法(CV)考察修饰前后的纳米传感针的电化学性能。拉曼光谱的结果表明Go合成成功。相比于裸针,G-AN在铁氰化钾溶液中的氧化还原峰电流增加,说明ERGO修饰层可以有效加速针灸针表面的电子传递。为了探究G-AN对pH的响应,我们采用开路电位法,对不同pH的磷酸盐缓冲液(PBS)进行测量。实验结果发现采用开路电位法测量的电位几秒钟便达到稳定,随着溶液pH的增加,电位信号负向增加。以pH对电位作图,可以看到在pH为2.0-10.0范围内,两者呈良好的线性关系,其线性方程为E=0.0209-0.0299pH,R_2=0.9921,线性方程显示传感针对pH响应灵敏度为29.9mV/pH。最后,我们将G-AN用于对神经递质多巴胺(DA)的检测。结果显示,相比于裸针,DA在G-AN上的电化学响应明显增强,且在抗坏血酸(AA)共存条件下能够成功区分DA与AA的不同氧化峰,说明G-AN有较好的选择性。在最优条件下,将传感针对DA进行定量的分析,结果显示在1.0×10~(-7)mol/L~1.0×10~(-5)mol/L范围内,DA的氧化峰电流与其浓度呈现良好的线性关系,方法的检出限为0.24μM,且将此传感针在PBS溶液中放置一周后或插入鼠脑组织后,修饰层均呈现较好的稳定性。最后采用标准添加法,此传感针实现了人体血清环境中DA的检测。第二部分:纳米传感针活体在穴实时监测一氧化氮首先在铁卟啉和Go水溶液中,加入水合肼与氨水,通过一步还原法制备了卟啉功能化的石墨烯,然后采用扫描电镜,紫外光谱法以及X射线能谱对其进行表征;制备传感针时先在针灸针上溅射一层金颗粒,然后用电化学方法将卟啉功能化的石墨烯沉积于针灸针尖端,针体部分绝缘。制备的传感针结合了石墨烯优越的电化学性能与铁卟啉分子良好的催化性能,实现了细胞水平以及穴位处NO的实时监测。实验结果显示,溶液环境中,NO在此传感针上的电化学响应比裸针明显增强,说明功能化石墨烯修饰层能够有效加速针灸针表面的电子传递。在干扰物存在的条件下能够成功检测NO,说明此传感针抗干扰能力强。在最优条件下,将该传感针用于溶液中NO的定量分析,结果显示在5.0×10~(-9)mol/L~2×10~(-7)mol/L范围内,NO的氧化峰电流与其浓度呈现良好的线性关系,方法检出限为3.2nM,将传感针置于1mkcl溶液中保存10天后,其电流信号仍保持在初始电流信号的82%以上,显示该传感针具有较好的稳定性。随后,将此传感针用于细胞水平NO的检测。精氨酸(L_-Arg)在细胞一氧化氮合酶(NOS)的催化作用下可以形成NO。实验结果显示,当加入L_-Arg刺激细胞时,电流信号明显增大,随时间增长又趋于稳定;而当精氨酸甲酯(l-name)与细胞共孵育后,再加入L_-Arg刺激细胞,由于l-name的抑制作用,没有检测到NO的响应电流。没有细胞存在情况下,加入L_-Arg刺激,也不会产生电流信号的变化。说明我们制备的功能化的针灸传感针可以实时检测细胞水平NO的释放。在此基础上,利用该传感针在大鼠穴位处进行活体实时NO监测实验,将功能化的传感针分别刺入成年大鼠不同穴位,足三里、曲池和中腕,当加入L_-Arg刺激穴位时,发现电流信号明显增加,说明在L_-Arg刺激下NO会在穴位处释放并能被实时监测到。作为空白实验,在穴位处加入PBS时,无明显电流信号变化,说明监测到的NO信号是在穴位通过L_-Arg的刺激而产生的,实验进一步说明该传感针具有活体实时检测的能力。第三部分:中药活性成分对细胞水平NO释放的影响NO产生或释放异常可能介导多种疾病的发生和发展。因此调控NO生理水平具有极其重要的治疗意义。实验涉及的四种单味药有青藤、益母草、葛根和大蒜,其主要活性成分分别为青藤碱、水苏碱、葛根素以及大蒜素。首先观察四种药物对细胞活性的影响,人体脐静脉内皮细胞(HUVRC_s)培养在96孔细胞培养板中,与不同浓度的药物作用24h后,用mtt法和荧光染色法观察细胞的活性,结果显示不同药物在50μg/ml浓度或者更低浓度对内皮细胞没有明显的毒性作用。采用NO还原酶试剂盒方法检测不同药物培养下细胞NO释放水平,通过实验数据可以得知,青藤碱与水苏碱对HUVRC_s中NO释放有抑制的作用,而葛根素和大蒜素对HUVRC_s中NO释放有促进的作用。再者,将纳米传感针置于细胞培养皿中,并加入L_-Arg刺激,使用电化学三电极系统,实时电流法进行检测不同药物对NO释放电流信号的影响。在药物共孵育的HUVRC_s中加入L_-Arg刺激,其电流信号与无药物的对照组有明显不同。水苏碱和青藤碱作用组电流明显要小于对照组;而葛根素和大蒜素作用组电流要高于对照组电流。说明此传感针检测的中药调控NO水平结果与试剂盒检测结果一致。结论1.将纳米技术与传统针灸针相结合,制备了纳米材料功能化的针灸传感针。2.所制备的纳米传感针具有灵敏度高,选择性好,修饰层稳定等优点。3.石墨烯修饰的传感针实现了对pH以及神经递质DA的检测,且可以用于血清环境中DA的检测。4.卟啉功能化石墨烯修饰的传感针实现了细胞水平以及活体在穴实时NO的监测。5.中药活性成分水苏碱和青藤碱可以抑制细胞中NO释放;相反,葛根素和大蒜素可以促进NO释放。
【学位授予单位】:湖北中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R285;R245;TP212

【参考文献】
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