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《湖北中医药大学》 2018年
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“凤眼片枳壳”缓燥炮制机理研究

张金莲  
【摘要】:1.目的枳壳为常用理气药,其饮片生产一般按2015年版《中国药典》的方法切为薄片(正文称为“枳壳片”)。“凤眼片枳壳”(正文称为“凤眼片”)为江西樟帮地方特色饮片,其制备工艺独到,所生产饮片较药典法枳壳片在作用上有一定优势,燥性较为缓和。本实验通过对两者进行化学成分对比研究、健脾和燥性差异性研究以及采用分子生物学方法探讨主要成分对燥性影响的机理,最终初步阐明“凤眼片枳壳”炮制缓燥的物质基础和原理。2.方法2.1超高效液相色谱与飞行时间质谱联用鉴别枳壳醇提物化学成分采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术对枳壳片70%乙醇提取物的成分进行了定性分析,在正离子模式下进行化合物鉴定。2.2凤眼片与枳壳片醇提物化学成分差异研究采用HPLC技术建立了枳壳饮片的HPLC指纹图谱,选出共有峰为指纹峰,并与枳壳片进行比较;进一步采用UPLC-Q-TOF-MS/MS对枳壳片、凤眼片成分进行分析,使用Markerview、SIMCA-P14.1软件,采用PCA、OPLS-DA分析,找寻到凤眼片与枳壳片的差异成分。2.3凤眼片与枳壳片醇提物改善胃肠功能作用比较选择功能性消化不良大鼠为动物模型,以大鼠体重、食量、小肠推进率、胃残留率、血清GAS、血清VIP、血浆MTL、胃组织的病理变化为考察指标,进行凤眼片与枳壳片70%乙醇提取物改善胃肠功能作用的比较研究。2.4凤眼片与枳壳片醇提物及萃取部位对津液影响的比较选择正常小鼠为研究对象,以饮水量、全血黏度、颌下腺AQP5含量为考察指标,对凤眼片与枳壳片70%乙醇提取物的津液影响指标进行比较研究。选择功能性消化不良大鼠为模型动物,以其唾液流率、颌下腺AQP5含量为指标,对凤眼片与枳壳饮片70%乙醇提取物的津液影响指标进行比较研究。选择正常小鼠为研究对象,以全血黏度、颌下腺AQP5含量为指标,对凤眼片与枳壳片不同萃取部位的津液指标的进行比较研究。2.5凤眼片与枳壳片醇提物差异成分与AQP5的关联分析采用正交偏最小二乘法找寻与AQP5密切关联的化合物,且此化合物与AQP5呈负相关的差异成分,使用HPLC确定差异成分归属的萃取部位。2.6凤眼片与枳壳片萃取部位、化合物对HSG细胞AQP5的影响采用人下颌下腺细胞HSG为研究对象,以HSG细胞AQP5 mRNA表达为指标,对凤眼片及枳壳片的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水部位抑制AQP5 mRNA表达作用的差异进行研究;以HSG细胞Western blot法AQP5蛋白表达为指标,对乙酸乙酯部位及化合物3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮等的差异进行研究。3.结果3.1超高效液相色谱与飞行时间质谱联用鉴别枳壳醇提物化学成分在正离子模式下共鉴定出46个化合物。其中黄酮类化合物33种,如忍冬苷、新圣草枸杞苷、圣草枸杞苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、柚皮素、柚皮苷元-7-O-葡萄糖苷等;香豆素类化合物10种,如伞形花内脂、圣草酚、橘皮内酯、水合橘皮内酯、花椒毒酚、栓翅芹内酯等;柠檬苦素类化合物柠檬苦素、诺米林;总酚酸类化合物阿魏酸。结合基峰图及二级碎片离子数据,推导了柚皮苷、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮、5-去甲川陈皮素等化合物质谱裂解规律。3.2凤眼片与枳壳片醇提物化学成分差异研究建立了枳壳饮片的HPLC指纹图谱,选出11个共有峰为指纹峰;与枳壳片相比,凤眼片相似度在0.793~0.886,差异较大。进一步采用的UPLC-Q-TOF-MS/MS对枳壳片、凤眼片成分进行分析,找寻到凤眼片与枳壳片的差异成分有伞形花内酯、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、柠檬苦素、柚皮苷元-7-O-葡萄糖苷。3.3凤眼片与枳壳片醇提物改善胃肠功能作用比较结果显示,枳壳片、凤眼片高中低剂量组可提高模型大鼠的体重(P0.01)和食量,低剂量组体重、高中低剂量组食量指标上无差异(P0.05);枳壳片高中低剂量组、凤眼片高剂量组均可提高模型大鼠的小肠推进率,降低胃残留率,差异具有统计学意义(P0.01 or P0.05)。高中低剂量组枳壳片、凤眼片均可提高模型大鼠的GAS含量(P0.01),中剂量组凤眼片GAS含量高于枳壳片。高中低剂量组枳壳片、凤眼片均可显著提高模型大鼠的MTL含量(P0.01)。高中低剂量组枳壳片、凤眼片均可下调模型大鼠的VIP(P0.01),高中低剂量组凤眼片的VIP值低于枳壳片,更接近正常组。从病理切片的结果显示,模型组大鼠胃组织有轻度炎症,而给药组未见明显病理改变。3.4凤眼片与枳壳片醇提物及萃取部位对津液影响的比较正常小鼠结果显示,在饮水增加量指标上,枳壳片高低剂量组高于正常组,差异有统计学意义(P0.01);凤眼片高低剂量组低于正常组,差异有统计学意义(P0.01)。两种枳壳饮片醇提物高低剂量组可提高正常小鼠全血黏度,枳壳片高低剂量组差异具有显著性(P0.01),枳壳片全血黏度值大于凤眼片。两种枳壳饮片醇提物高低剂量组可降低正常小鼠颌下腺AQP5的含量,枳壳片高低剂量组差异具有显著性(P0.01),而凤眼片高低剂量组与正常组无差异(P0.05)。功能性消化不良大鼠的结果显示,两种枳壳饮片醇提物高中低剂量组均可提高功能性消化不良大鼠的唾液流率(P0.01)和颌下腺AQP5含量。凤眼片高于枳壳片,唾液流率差异具有统计学意义(P0.01)。不同萃取部位的结果显示,提高全血黏度、下调AQP5含量较强的为乙酸乙酯、二氯甲烷部位。3.5凤眼片与枳壳片醇提物差异成分与AQP5的关联分析正交偏最小二乘法分析法标准化回归系数显示3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮与AQP5呈负相关,是负相关成分中贡献值最大化合物,而柚皮苷元-7-O-葡萄糖苷、柠檬苦素等呈正相关;进一步采用HPLC法验证3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮主要存在于二氯甲烷与乙酸乙酯部位。3.6凤眼片与枳壳片萃取部位、化合物对HSG细胞AQP5的影响结果显示,抑制AQP5 mRNA表达作用枳壳片强于凤眼片,枳壳片乙酸乙酯部位强于其他部位。以HSG细胞AQP5 mRNA表达和Western blot法AQP5蛋白表达结果显示,3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮显著抑制AQP5蛋白表达(P0.05),橙皮苷及乙酸乙酯部位作用不明显(P0.05)。4.小结4.1超高效液相色谱与飞行时间质谱联用鉴别枳壳片醇提物化学成分在UHPLC-Q-TOF-MS/MS正离子模式下共鉴定出46个化合物。其中主要为黄酮类化合物,其次为香豆素类、柠檬苦素类及总酚酸类化合物。其中对圣草酚、柚皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲基黄酮、橙皮油素、5-去甲川陈皮素、伞形花内酯等成分采用对照品进行比对,对部分化合物的质谱裂解规律进行了推导。4.2凤眼片与枳壳片醇提物化学成分差异研究运用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术、Markerview、SIMCA-P14.1软件,找寻并鉴别了凤眼片与枳壳片醇提物的差异成分4个,分别为伞形花内酯、3,5,6,7,8,3',4'-七甲基黄酮、柚皮苷元-7-O-葡萄糖苷、柠檬苦素。4.3凤眼片与枳壳片醇提物改善胃肠功能作用比较凤眼片与枳壳片醇提物均可改善功能性消化不良大鼠的体重、食量、小肠推进率、GAS、MTL、VIP水平及胃组织的轻度炎症。小肠推进率枳壳片高于凤眼片,高低剂量组无显著差异;胃残留率枳壳片低于凤眼片,中剂量组无显著差异;GAS值枳壳片高于凤眼片,低剂量组无显著差异;MTL值高中低剂量组枳壳片显著高于凤眼片,VIP值凤眼片低于枳壳片,更接近正常值。显示凤眼片在部分指标上相当或优于枳壳片。4.4凤眼片与枳壳片醇提物及萃取部位对津液影响的比较枳壳片醇提物在提高正常小鼠全血黏度、饮水量,降低正常小鼠颌下腺AQP5的含量作用强于凤眼片,而上调模型大鼠唾液流率、AQP5含量的作用不及凤眼片,显示更强的燥性;提高全血黏度、降低颌下腺AQP5含量的主要部位为二氯甲烷及乙酸乙酯部位。4.5凤眼片与枳壳片醇提物差异成分与AQP5的关联分析通过分析得到与AQP5呈负相关、贡献值最大的成分为3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮,呈正相关的成分为柚皮苷元-7-O-葡萄糖苷、柠檬苦素等。推断凤眼片缓燥可能与降低3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮成分的含量,升高柚皮苷元-7-O-葡萄糖苷、柠檬苦素等的含量有关。4.6各萃取部位及单体化合物对HSG细胞AQP5的影响对人下颌下腺细胞AQP5 mRNA基因表达抑制作用显示枳壳片强于凤眼片,枳壳片乙酸乙酯部位强于其他部位。3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橙皮苷抑制人下颌下腺细胞AQP5 mRNA基因表达作用强于新橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷和柚皮苷混合物,3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮可显著抑制HSG细胞AQP5蛋白表达,而橙皮苷的抑制作用不明显,可见3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮是枳壳的燥性成分之一。凤眼片缓燥可能与降低3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮的含量有关。综上,健脾作用结果对比显示:凤眼片与枳壳片药效作用相近;燥性结果对比提示:前者弱于后者,风眼片炮制工艺可缓和燥性。本课题初步明确了樟帮法风眼片枳壳缓和燥性的主要物质基础和关键成分的作用机理,结果可为枳壳炮制缓燥作用提供科学依据,为进一步优化凤眼片炮制工艺提供参考。
【学位授予单位】:湖北中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R283

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