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《湖北中医学院》 2005年
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乳黄片对A型肝性脑病大鼠星形胶质细胞结构与蛋白的影响

陈军梅  
【摘要】:目的 A型肝性脑病(hepatic encephalopathy,HE)是急性肝功能衰竭并发的大脑功能障碍,该病来势凶险,生存率仅为20%。目前,氨中毒学说被公认为仍处于HE众多发病机制假说的中心地位。通常认为它是通过干扰脑的能量代谢引起HE的发生。近年来,国内外学者认为,氨导致星形胶质细胞结构功能失常,可能是HE发病的主要机理。祖国医学称本病为“肝厥”。根据中医理论与临床经验,导师张赤志教授认为本病病因病机为邪毒直犯肝脏,肝失疏泄,脾失健运,肠道传导失司,腑浊内生,化热生痰,上扰神明;病位在肝、心脑与胃;结合“肝与大肠相通,肝病宜疏通大肠”和“上病下治”治疗原则,立通下解毒法;选用酒制大黄和乳酸菌素组成乳黄片治疗HE,临床和前期动物实验均显示有很好的降氨作用,能明显改善HE症状与体征,提高存活率。为进一步明确乳黄片抗HE的作用位点与机制,本课题从动物和细胞实验两方面研究该药对星形胶质细胞结构和蛋白表达的影响。 方法 (1)200±20gSPF级雄性Wistar大鼠96只,随机分为6组,每组16只:正常对照组(A组)、模型组(B组)、乳果糖组(C组)、乳黄片小中大剂量组(D、E、F组)。大鼠禁食过夜(14h以上),除A组外其余各组采用目前应用最成熟的硫代乙酰胺(TAA)诱导法(TAA250mg/kg灌胃两次,每次间隔24h)复制A型HE动物模型。在TAA首次造模前2h,A、B组每只大鼠灌胃生理盐水1ml/100g体重,其余各组给等体积/重量比的相应药物。以后每8h重复给药一次。自首次TAA造模至实验结束,每隔8h皮下注射3ml 10%葡萄糖、2ml含等量生理盐水与20μmol/lKCl溶液的混合液以防止低血糖。实验30h后行脑电图(EEG)检测,之后处置动物取材。实验过程中,密切观察大鼠行为学改变。(2)眼眶取血,检测血清ALT和血氨浓度。(3)伊文思蓝(EB)渗出法检测血脑屏障(BBB)通透性。透射电镜观察星形胶质细胞在内的BBB超微结构变化。(4)小脑延髓池处抽取脑脊液,检测脑脊液氨浓度。取大脑皮层组织,制成匀浆,高效液相色谱法检测谷氨酰胺含量。取整个脑组织,干湿重法检测脑组织含水量比。(5)免疫组织化学法观察大脑皮层组织星形胶质细胞结构蛋白-胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。(6)半定量逆转录-多聚酶链法(RT-PCR)检测大鼠皮层脑组织谷氨酸转运体GLT-1mRNA的表达情况。(7)制备乳黄片脑脊液,作用暴露于5mM浓度氯化铵的星形胶质细胞CRL-2541 48h,MTT法检测其活性,免疫细胞化学法检测GFAP表达情况。 结果 (1)乳黄片可明显改善A型HE大鼠行为异常和EEG变化,显著降低血清ALT与血氨水平(P0.01),提高存活率;大、中、小剂量组疗效均优于乳果糖组,且以中剂量组最佳;(2)乳黄片能明显降低A型HE大鼠脑组织EB含量(P0.01),显著改善星形胶质细胞在内的BBB超微结构受损情况,以中剂量组疗效最优;(3)乳黄片可显著降低A型HE大鼠脑脊液氨浓度、脑组织谷氨酰胺含量及脑含水量比(P0.01),以中剂量组下降最明显;(4)乳黄片能显著上调A型HE大鼠大脑皮层组织星形胶质细胞GFAP的表达,升高 湖北中医学院 博士学位论文 其阳性细胞数和平均光密度(P0.01),以中剂量上升最显著;(5)乳黄片能 明显上调A型HE大鼠大脑皮层组织星形胶质细胞上谷氨酸转运体 GLT一lmRNA的表达,以中剂量上升最明显;(6)乳黄片脑脊液能显著升高smM 浓度氨环境中星形胶质细胞CRL一2541的吸光度,上调GFAP的表达。 结论(1)高氨是A型HE发病的病因基础之一,其对星形胶质细胞结构和蛋 白的损害在HE的发病机理中占有重要作用。其中,氨及其代谢产物一谷氨 酞胺的过量堆积可引起星形胶质细胞结构损害和GFAP蛋白表达缺失,导致 血脑屏障完整性受损,通透性增加和血管源性脑水肿的发生;继发的谷氨 酸转运体蛋白(如GLT一1)基因表达缺失,可导致谷氨酸大量积于突触间隙, 引起神经元毒性和脑水肿的发生。(2)乳黄片有良好防治A型HE的作用,可 能是通过以下途径实现的:保肝护肝,降低氨(血和脑脊液氨)与谷氨酞胺 浓度,进入血脑屏障,改善星形胶质细胞结构受损与蛋白表达缺失情况。 (3)乳黄片抗HE的作用位点可能为星形胶质细胞。 关键词:肝性脑病/A型@乳黄片星形胶质细胞实验研究
【学位授予单位】:湖北中医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R285.5

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