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《湖北中医学院》 2007年
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抗纤软肝颗粒对肝星状细胞整合素介导的MAPK信号通路的影响

刘林  
【摘要】: 目的肝纤维化(liver fibrosis,LF)为各种慢性肝疾患所导致的一系列损伤-修复,最终肝组织内细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)过度沉积的反应。由于发生的机制比较复杂,至今对肝纤维化的了解还很有限,因此制约了肝纤维化治疗的发展。肝星状细胞(Hepatic Stellate cell,HSC)作为ECM的主要生成细胞,被认为是各种肝脏损伤引起肝纤维化的中心环节。在肝纤维化的发生发展机制中,对肝星状细胞激活的启动、维持,细胞外基质也起着重要的作用。HSC与ECM之间存在着复杂的相互作用,而其相互作用主要经整合素介导。黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是整合素信号途径中连接整合素与下游信号分子的媒介,是胞内多个信号途径的交汇点。其中,以FAK为中心的整合素信号转导通路主要是Ras-MAPK途径,细胞外信号调节激酶1/2(extracellularsignal-regulated kinase,ERK1/2)是MAPK家族中研究最为清楚的成员,其通路Ras-RAF-MEK-ERK参与细胞多种活动。抗纤软肝颗粒组方在临床上有良好的疗效,现将其制成适应临床需要的颗粒剂。在既往研究的基础上,应用体外细胞培养技术,从肝星状细胞与细胞外基质的相互作用着手,以整合素、FAK、ERK1/2为研究切入点,研究抗纤软肝颗粒对肝星状细胞整合素信号通路的影响,由此阐释抗纤软肝颗粒抗肝星状细胞增殖与诱导凋亡的作用机制。 方法:(1)首先根据处方中丹参、莪术及鳖甲所含化学成分的理化性质及其药理作用,以提取丹参酮ⅡA和莪术挥发油为目的,确定抗纤软肝颗粒的制备制成工艺,用正交设计的直观分析优化几种辅料的用量确定最终的制剂处方。(2)考察成品的体外溶出度;同时对之进行全面的质量控制研究,制定质量标准。(3)运用体外细胞培养技术,以HSC-T6细胞系为研究对象,分为空白包被+10%生理盐水血清组、FN包被+10%生理盐水血清组、FN包被+5%kxr组、FN包被+10%kxr组、FN包被+20%kxr组。按以上分组进行药物干预,各组FN(3μg/ml)均于kxr加入前30分钟加入,干预后继续培养48h。(4)采用MTT法测细胞增殖,采用甲苯胺蓝染色方法测定细胞黏附率;Annexin V-PE/7-ADD法测定Hsc凋亡。(5)应用免疫细胞组织化学方法检测HSC整合素α5β1蛋白的表达。(6)应用免疫细胞组织化学方法检测HSC FAK蛋白的表达,采用RT-PCR法测定FAKmRNA的表达。(7)应用免疫细胞组织化学方法检测HSC ERK1蛋白的表达,采用RT-PCR法测定ERK1mRNA的表达。 结果:(1)丹参的渗漉最佳工艺为:用90%的乙醇进行渗漉,流速为0.6ml/min,乙醇用量为12倍,浸泡时间为16h;鳖甲超微粉碎后置显微镜下观察,可见粒径小于5um的多于50%,粒径小于10um的多于90%;莪术挥发油的最佳提取工艺为加水8倍,浸泡时间为0.5h,煎煮5h。莪术挥发油的最佳包合工艺为挥发油:β-CD(1∶4),搅拌时间为60min,包合温度为50℃,以10000r/min的转速进行包合。制备工艺中确定以糊精为辅料,药物:糊精:1∶0.5,以50%乙醇为润湿剂,加入0.4%倍CMC作为助悬剂,过16目筛制粒,50℃干燥,10目筛整粒。(2)含量测定方法学考察实验中,其回收率合格,精密度、稳定性和重现性良好,说明了所制定的含量测定方法的合理性和可行性;样品在考察期各项指标无明显变化,均符合规定。(3)与FN组比较,kxr各组均可以抑制HSC增殖,存在显著差异(P<0.01),kxr各组均可以诱导HSC凋亡,与FN组及空白对照组比较存在显著差异(P<0.01),与空白对照组比较,kxr各组均可以抑制FN与HSC的粘附,存在显著差异(P<0.01)。(4)抗纤软肝颗粒含药血清组HSC的整合素α5β1蛋白表达显著下调,与空白对照组及FN组相比有显著性差异(P<0.01) (5)抗纤软肝颗粒含药血清组HSC的FAKmRNA、蛋白表达均显著下调,分别减少了43.32%(11.93%),56.52%(39.52%),70.27%(53.42%),与对照组及FN组相比,KXR1组(p<0.05),KXR2组、KXR3组(p<0.01),均有显著性差异。(6)抗纤软肝颗粒含药血清组HSC的ERK1mRNA、蛋白表达均显著下调,分别减少了39.53%(8.93%),47.45%(35.62%),56.78%(50.12%),与对照组及FN组相比,KXR1组(p<0.05),KXR2组、KXR3组(p<0.01),均有显著性差异。 结论(1)所确定的制备工艺稳定可行,质量控制方法合理可行。(2) FN能够刺激HSC增殖,由此可知细胞外基质通过整合素介导对肝星状细胞激活的启动、维持起着重要的作用。实验发现,抗纤软肝颗粒含药血清可以抑制由FN刺激的HSC增殖,并诱导HSC凋亡,并能抑制HSC的粘附,呈剂量依赖关系。抗纤软肝颗粒能够下调HSC整合素α5β1的表达,能够在转录及翻译水平抑制FAK及ERK1mRNA、蛋白的表达。(3)抗纤软肝颗粒含药血清有较好的抑制HSC增殖,并诱导HSC凋亡的作用,可能是通过以下途径实现的:抑制或拮抗了细胞外基质与其受体整合素的结合,从而抑制细胞外基质与HSC的粘附;通过下调整合素蛋白的表达,降低下游信号分子FAK及ERK1mRNA、蛋白的表达,阻抑了整合素激活的FAK信号途径中的Ras依赖的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径,即Ras-RAF-MEK-ERK通路。这可能是其抗肝纤维化的作用靶点之一。
【学位授予单位】:湖北中医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285.5

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