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《湖北中医学院》 2007年
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益肾汤联合西药延缓小鼠IgA肾病肾损害进展的作用及机制

万启军  
【摘要】: 目的:IgAN已成为全世界公认的发病率最高的原发性肾小球疾病,也是慢性肾脏病的主要病理类型。目前,西医多根据IgAN患者24小时尿蛋白定量、肾功能状况以及肾脏病理学诊断的结果,结合患者的年龄等因素选用包括肾上腺糖皮质激素、免疫抑制剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体拮抗剂(ARB)、鱼油、抗凝剂、抗血小板聚集等药物以及扁桃体摘除等治疗措施。单用西药治疗IgAN存在着或疗效有限、或副作用较大等缺点。应用中药治疗IgAN已有近20年的历史,尤其是近年来,中西药联合治疗IgAN无论是在临床还是在实验研究方面均取得了长足的进步。综观IgAN临床治疗的有关方药,IgAN的主要治法包括“益气养阴”法和“滋养肝肾”法。因此,本研究拟通过建立BALB/c小鼠IgAN模型,从细胞凋亡及细胞因子角度、mRNA转录及蛋白质翻译水平研究益肾汤(经验方“益肾汤”是在古代名方“六味地黄丸《小儿药证直诀》”基础上,结合临床用药体会加减化裁而成)联合西药(强的松+依那普利)延缓小鼠IgAN肾损害进展的作用及机制,对比研究“正常对照组、模型对照组、强的松+依那普利组、强的松+依那普利+益肾汤低浓度组、益肾汤低浓度组、强的松+依那普利+益肾汤高浓度组、益肾汤高浓度组”小鼠:24小时尿蛋白定量、血尿定性、肾小球光镜、免疫银光半定量改变、小鼠肾小球系膜细胞凋亡及其调控基因Bax及Bcl-2的表达、肾组织TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、PAI-ImRNA表达及蛋白质含量的差异。从而探讨益肾汤联合强的松+依那普利延缓小鼠IgAN肾损害进展的作用及可能机制。同时探讨益肾汤与强的松及依那普利合用在延缓小鼠IgAN肾损害的进展方面是否优于单用“西药”或单用“中药”,为临床应用中西药联合方法治疗IgAN患者探索理论依据。 方法: 1造模及模型鉴定雌性BALB/c小鼠105只,鼠龄8~10周,体重18~22克。适应性喂养一周后,在分正常对照组和造模组之前,随机抽样36只小鼠,以每2只小鼠为一组分批置于代谢笼中,收集24小时尿量进行尿蛋白定量及血尿定性检测,结果,所抽样本小鼠血尿检查均阴性,但36只抽检小鼠共18次尿蛋白定量结果显示,正常小鼠每日有少量尿蛋白排出(5.34±1.12 mg/d)。随机将所有105只小鼠分为正常对照组(15只)和造模组(90只),按文献介绍,用“口服牛血清白蛋白联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B”的方法制作小鼠IgAN模型。造模至第5周末时,造模组共死亡3只小鼠,而正常对照组无小鼠死亡。 在造模型的第5周末,按上述方法分别检测对照组和造模组小鼠尿蛋白定量及血尿定性的差异。分别在正常对照组和造模组随机抽样3只小鼠,在摘除小鼠眼球取血(检测尿素氮、肌酐)后,予2%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉,取肾行以下检查: 光学显微镜检查:小鼠肾组织用多聚甲醛固定→石蜡包埋,3μm切片→二甲苯3缸→无水酒精→95%酒精→90%酒精→80%酒精→70%酒精→蒸馏水,分别行HE、MASSON、PAS、六胺银染色。 免疫荧光(直接法)检查:取新鲜的肾组织OCT包埋→冰冻切片4~6μm→PBS液洗5 min×3次→室温下微干→滴加FITC标记的兔抗小鼠IgA(1:400)→4℃暗盒过夜→PBS液洗5 min×3次→室温下晾干、封片→荧光显微镜下观察、对照、摄像。免疫荧光半定量标准参照国内外通用的五级法(0~++++)分级。 肾组织形态学改变图像分析:取PAS染色的切片行显微镜检查,光镜放大400倍,每个标本随机计数8~10个肾小球,利用德国KONTRON IBAS 2.5全自动图像分析系统,用鼠标标出肾小球系膜区并计算其面积,同时测出毛细血管丛面积,算出肾小球系膜区占增个毛细血管丛面积的百分比。 2动物分组及药物治疗 经过以上血尿素氨、肌酐、尿蛋白定量、血尿、肾脏光镜、免疫荧光以及肾脏系膜区增生程度的检查,明确IgAN模型成功后,随机将尚存的84只IgAN小鼠分为以下6组(每组小鼠14只)同时进行对照研究: (1)模型对照组:1 mL蒸馏水灌胃,qd。 (2)强的松+依那普利组:强的松5 mg/kg/d和依那普利10 mg/kg/d混悬于1 mL蒸馏水中灌胃,qd。 (3)强的松+依那普利+益肾汤低浓度组:强的松5 mg/kg/d和依那普利10 mg/kg/d溶于低浓度益肾汤1mL中灌胃,qd。 (4)益肾汤低浓度组:低浓度益肾汤1mL灌胃,qd。 (5)强的松+依那普利+益肾汤高浓度组:强的松5 mg/kg/d和依那普利10 mg/kg/d溶于高浓度益肾汤1 mL中灌胃,qd。 (6)益肾汤高浓度组:高浓度益肾汤1mL灌胃,qd。连同正常对照组(尚存小鼠12只、1 mL蒸馏水灌胃,qd),共7组。 第6周始,除正常对照组外,其余各组继续按文献贪绍的方法注射牛血清白蛋白和葡萄球菌肠毒素B。每组小鼠除上述药物治疗方案不同外,所有小鼠均自由饮水和进食。观察至12周末实验结束时,7组小鼠分别按上述方法收集尿液行24小时尿蛋白定量、血尿定性检查;摘除眼球取血(行尿素氮、肌酐检查)后,再予2%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉,沿小鼠腹腔正中线切开,摘取肾脏,沿冠状线将肾脏分成两半,再沿冠状面将肾脏继续切分,取外围的肾皮质一部分做冰冻切片行免疫荧光IgA检查;另一部分做石蜡切片,用10%的中性甲醛固定,行石蜡包埋切片,分别作HE、MASSON、PAS及PAM染色,待病理检查。取材完毕后分别按实验设计完成以下检测: 3不同治疗方案对各组小鼠疗效及肾脏病理的影响 按上述方法分别检测7组小鼠:24 h尿蛋白定量、血尿定性、血尿素氮、肌酐以及肾小球系膜区面积、肾小球毛细血管丛面积、肾小球系膜区占增个毛细血管丛面积的百分比,同时计算各组小鼠肾脏组织免疫荧光半定量。分别进行组间比较及两两比较。 4各组小鼠肾脏系膜细胞凋亡及其调控基因Bax和Bcl-2表达的差异 用原位末端标记(TUNEL)法检测肾脏系膜细胞凋亡,操作按试剂盒说明进行。判定结果(凋亡细胞核固缩、碎裂、呈棕色颗粒)。光镜下每份标本计数100个系膜细胞及凋亡细胞,按凋亡细胞/细胞总数×100%计算凋亡率。 免疫组化SABC法,染色步骤按常规方法进行。镜下观察小鼠肾脏系膜区蛋白染色情况,选取细胞分布均匀的5个高倍(×400)视野作为观察区,分别计算各级别细胞数,求5个视野内细胞数的平均值,计算阳性细胞数,以百分数表示。判断结果(低倍镜下观察背景颜色,高倍镜下观察肾小球系膜区染色强度并按常规标准记分:Bcl-2及Bax蛋白表达强度依照阳性产物着色深浅及阳性细胞数的多少分为4级:(一):无阳性细胞,阳性细胞数<10%或背景同空白对照者;(+):仅有<25%的细胞明显阳性,或大多数弱阳性;(++):25~50%的细胞明显阳性;(+++):>50%的细胞明显阳性。 5应用FQ-RT-PCR方法检测各组小鼠肾组织TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、PAI-1 mRNA的表达 5.1肾组织RNA的提取 肾组织块置匀浆器,加Trizol 1 mL,冷冻匀浆,转置于1.5 mLEppendorf管,加入氯仿0.2 mL,用力摇动15s,15~30℃孵育2~3 min,4℃12 000 r/min离心15 min,取上清液至新的1.5 mL Eppendorf管,加与上清液等体积的异丙醇,15~30℃孵育样品10 min,4℃12 000 r/min离心10 min,弃上清液,75%乙醇(含DEPC水)洗涤沉淀1次,4℃7500 r/min离心5 min,弃乙醇,空气或真空干燥5~10 min(不要完全干燥),加DEPC处理水溶解RNA,-80℃保存备用。若长期保存,加入2.5倍体积乙醇,置-80℃保存。 5.2引物探针设计 在ABI 3900台式高通量DNA合成仪上应用Primer express2.0软件分别合成TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、PAI-1及GAPDH的Forward Primer、Reverse Primer、TaqMan Probe。 5.3逆转录反应 取4μL RNA模板做逆转录反应,仪器为PE 9600 PCR仪,反应体系如下:5×逆转录buffer 4μL,相应目标基因的上游引物0.4μL、下游引物0.4μL,dNTPs 0.5μL,MMLV 1μL,DEPC水9.7μL,RNA模板4μL,总体积20μL;反应条件为37℃1 h,然后95℃3 min。 5.4荧光定量PCR反应 反应体系:样本按以下反应体系进行:5×定量PCR buffer 10μL,相应目标基因的上游引物F 1μL、下游引物R1μL,dNTPs 0.5μL,相应目标基因的荧光探针1μL,Taq酶1.5μL,cDMA5μL,ddH_2O 30μL,总体积50μL。反应条件为93℃2 min,然后93℃45 s,55℃45 s,共40循环。 6免疫组化SABC法检测小鼠肾组织TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、PAI-1含量 6.1免疫组化染色流程 切片、贴片、晒干(60℃温箱中烤1~2 h)→二甲苯脱脂(每次5 min×3次)→梯度乙醇水化(无水乙醇10 min×2次、95%乙醇10 min×2次、75%乙醇×5 min)→3%过氧化氢室温孵育5~10 min(以消除内源性过氧化物酶的活性)→蒸馏水冲洗,PBS浸泡5 min×2次→1.5%的封闭血清30 min→分别滴加TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、PAI-1抗体(1:400),4℃过夜→PBS冲洗5 min×3次→二抗孵育30 min→PBS冲洗5 min×3次→孵育30 min→PBS冲洗5 min×3次→DAB显色→自来水从分冲洗、复染、透明、脱水、封片。 6.2肾组织TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、PAI-1阳性单位(Positive Unit PU)值的计算 取肾组织免疫组化切片,于显微镜下计数10个肾小球,光学放大400倍,图像摄入德国KONTRON IBAS 2.5全自动图像分析系统,应用PU值的计算公式计算PU值,以各组间的PU值进行比较。PU=100×(Ga-GA)/[(1-Aa)×G_(max)]。注:Ga:阳性反应的平均灰度级;GA:整个视野的平均灰度;Aa:阳性反应的面积密度;G_(max):设定的灰度最高级(所用的是256),所有数据均由系统自动给出。 结果 1 IgA肾病模型 造模第5周末时,造模组小鼠尿蛋白、血尿均高于正常对照组(P<0.05),而两组间血尿素氮、肌酐尚未见统计学差异(P>0.05)。光镜见:造模组小鼠肾小球体积轻度增大、系膜细胞和基质中重度增生、部分肾小球囊腔粘连、肾小球毛细血管管腔挤压变窄。而正常对照组小鼠肾小球未见明显异常。免疫荧光:造模组小鼠系膜区IgA免疫荧光强阳性,成团块状沉积;正常对照组几无IgA沉积,有统计学差异(P<0.01)。造模组小鼠系膜区面积、系膜区/肾小球面积的比值均明显高于正常对照组(P<0.05)。 2 IgAN模型小鼠肾脏系膜细胞凋亡及凋亡调控基因Bax和Bcl-2的变化 实验结束时,正常组小鼠有少量的系膜细胞凋亡,而模型组小鼠则几乎未发现系膜细胞凋亡,两组相比有统计学差异(P<0.05);正常组与模型组小鼠肾脏系膜区均有少量Bax表达,但两组相比无统计学差异(P>0.05);模型组Bcl-2的表达高于正常组,有统计学差异(P<0.01)。 3不同治疗方案对IgAN小鼠肾脏系膜细胞凋亡与Bax和Bcl-2表达的影响 本研究中两个浓度的益肾汤治疗组小鼠肾组织Bcl-2的表达均显著低于模型组(P<0.01),系膜细胞凋亡率、Bax的表达均显著高于模型组(P<0.01),提示益肾汤治疗IgAN的有效机制可能与“影响Bax和Bcl-2在肾小球系膜区的表达、诱导系膜细胞凋亡、抑制系膜细胞的增殖”有关。 在5个治疗组中,强的松+依那普利+益肾汤治疗组小鼠肾组织Bcl-2的表达均显著低于其他治疗组(P<0.01),而系膜细胞凋亡率、Bax的表达均显著高于其他治疗组(P<0.01),提示强的松+依那普利+益肾汤的联合治疗方案优于单用强的松+依那普利和单用益肾汤。 4不同治疗方案对IgAN小鼠尿蛋白定量、血尿定性及肾功能的影响 益肾汤高浓度组小鼠尿蛋白、血尿及肾功能指标均分别低于益肾汤低浓度组(P<0.05);强的松+依那普利组分别低于益肾汤低浓度与益肾汤高浓度组(P<0.05),但三组均分别低于模型对照组(P<0.05)。强的松+依那普利+益肾汤低浓度组与强的松+依那普利+益肾汤高浓度组之间无统计学差异(P>0.05),但分别低于单用强的松+依那普利和单用益肾汤组(P<0.05)。 5不同治疗方案对IgAN小鼠肾脏病理(系膜区面积、系膜区/肾小球面积比、系膜区IgA免疫荧光半定量)的影响 益肾汤低浓度组与高浓度组之间该三项指标无统计学差异(P>0.05);强的松+依那普利组分别低于益肾汤低浓度组与高浓度组(P<0.05)。强的松+依那普利组、益肾汤治疗组该三项指标均分别低于模型对照组(P<0.05);强的松+依那普利+益肾汤低浓度组与强的松+依那普利+益肾汤高浓度组之间无统计学差异(P>0.05),但分别低于单用强的松+依那普利组和单用益肾汤组(P<0.05)。 6不同治疗方案对IgAN小鼠肾组织中TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、PAI-1mRNA及蛋白质的表达的影响 本研究虽未证实益肾汤低浓度组与益肾汤高浓度组之间肾小球内TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、PAI-1mRNA及蛋白表达有统计学差异,但两个浓度的益肾汤治疗组小鼠肾组织中TGF-β1、PAI-1、TIMP-1的分泌及其mRNA表达均分别较IgAN模型组明显减轻,而MMP-9表达均分别强于模型对照组。在5个治疗组中强的松+依那普利+益肾汤治疗组TGF-β1、PAI-1、TIMP-1mRNA及蛋白表达最弱,而MMP-9表达最强。 结论 1造模组小鼠尿蛋白定量、血尿、肾小球系膜区面积、系膜区/肾小球面积的比值、光镜及免疫荧光等病理检查方面的结果均说明此次用“口服牛血清白蛋白联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B”的方法制作小鼠IgAN模型是成功的。 2 IgAN模型组小鼠具有明显的系膜细胞凋亡不足;同时,IgAN模型组小鼠存在Bax表达不足以及Bcl-2的表达增加,提示细胞凋亡及其调控基因Bax和Bcl-2在IgAN的发生和发展过程中起重要作用。 3 TGF-β1、MMP-9、TIMP-1及PAI-1mRNA及蛋白质的异常表达在IgAN的发生发展中均有重要作用。 4高浓度益肾汤在减轻IgAN小鼠的血尿、蛋白尿、稳定肾功能方面优于低浓度益肾汤,但在其它观测指标之间未观察到统计学差异。 5中药方剂益肾汤可以减轻IgAN小鼠的血尿、蛋白尿、稳定肾功能、调控小鼠肾脏系膜细胞凋亡及Bax和Bcl-2的表达、减轻TGF-β1、TIMP-1及PAI-1mRNA及蛋白质的异常表达、增强MMP-9 mRNA及蛋白质的表达,从而延缓IgAN肾损害的进展,但上述作用均不如强的松联合依那普利组明显。 6强的松+依那普利+益肾汤的联合治疗方案较单用强的松+依那普利治疗或者单用益肾汤治疗IgAN在减少尿蛋白、稳定肾功能方面有更好的疗效,同时在改善IgAN病理损害、调控系膜细胞凋亡及IgAN TGF-β1、MMP-9、TIMP-1及PAI-1mRNA及蛋白质的异常表达等方面也有一定的优势。
【学位授予单位】:湖北中医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R692.3

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