苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒orf129基因敲除实验

【摘要】：杆状病毒是一种双链DNA病毒,呈杆状,基因组大小在80Kb-180Kb,其中研究最广泛的是苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)。AcMNPV基因组的序列已见报道。AcMNPV orf129(Acl29)的同源基因存在于所有的Group I/II and GV基因组.。其编码产物P24在AcMNPV和OpMNPV中与BV和ODV都相关.AcMNPV E株的p24被一个转座原件被插断.。表明p24在杆状病毒生活史中似乎似乎是一个非必需基因。 本研究利用λ-red同源重组系统从AcMNPV基因组中敲除orfl29,已研究其功能。Ac129在AcMNPV基因组上的位置是nt(109900-110496)。其上、下游相邻基因分别是gp64(nt108179-109717)和gp16(nt110524-110844)。本项研究工作中敲除的orf 129的部分是nt109899-110192。基因敲除实验包括两个步骤：第一步,通过PCR扩增有两侧同源臂H1、H2和中间的庆大霉素乙酰转移酶组成的DNA片段。同源臂H1包含Ac129上游20bp序列和Gmr5’-端20 bp；H2包含Gmr3’-端20 bp和Ac129下游20 bp序列。PCR扩增中使用两个退火温度55℃和50℃。第二步是λ-Red同源重组。通过电转化将上述PCR产物转入E.coli DH10BAC细胞。E.coli DH10BAC中含有AcMNPV bacmid and pKD46质粒,pKD46质粒上含有编码同源重组酶的基因,能够使得PCR产物和Bacmid发生同源重组。