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《华中师范大学》 2017年
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斜蚊夜蛾Noduler基因的功能研究

胡巧巧  
【摘要】:Noduler基因最早在印度柞蚕(Antheraeamylitta)中被发现和命名。研究表明这一基因参与昆虫结节反应的调控。后来在家蚕(Bombyx mori)中的研究还发现该基因参与昆虫酚氧化酶原激活反应的调控。本研究中我们克隆了斜纹夜蛾Noduler基因,体外原核表达并纯化出Noduler重组蛋白,制备了多克隆抗体,并进行一系列的免疫相关的实验。最后又利用RNA干扰的方法研究了No uler基因在斜纹夜蛾体内的免疫功能。实验结果如下:1.Noduler基因的序列分析:Noduler基因具有一个501bp的开放阅读框,编码一个具有166个氨基酸的Noduler蛋白。软件预测表明该蛋白的等电点为9.33,分子量为17.35KDa。将斜纹夜蛾的Noduler基因的氨基酸序列与其他几种鳞翅目昆虫Noduler基因的氨基酸序列进行多重序列比对,结果显示该基因与鳞翅目美国白蛾Noduler的序列相似性最高,为83%。2.组织特异性分析:RT-PCR和荧光定量PCR分析表明Noduler基因在斜纹夜蛾的血细胞、脂肪体、中肠、表皮、马氏管五个组织中都有表达,在血细胞中的表达量最高。3.免疫刺激后Noduler基因表达量的变化:荧光定量PCR检测结果显示在革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichiacoli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)刺激后,斜纹夜蛾Noduler基因在血细胞和脂肪体中的表达量显著上调;同时在两种菌刺激后,Western Blo检测结果显示血浆中的Noduler蛋白表达量也都显著上调。这些结果共同说明Noduler基因很可能在斜纹夜蛾先天性免疫反应中发挥着重要的作用。4.Noduler基因体外功能实验:Noduler重组蛋白可以与大肠杆菌及金黄色葡萄球菌结合;Noduler重组蛋白体外可以参与酚氧化酶原的激活反应。5.RNAi实验:给斜纹夜蛾四龄幼虫注射dsNoduler,通过荧光定量PCR及Western Blot验证该基因被敲降后,进行了以下的功能试验:(1)酚氧化酶活性检测:血浆中酚氧化酶的活性显著的降低,证明该基因可能参与酚氧化酶原激活反应的调控;(2)形成结节能力检测:敲降组斜纹夜蛾在注射金黄色葡萄球菌后形成结节数量显著低于对照组,表明该基因可能参与斜纹夜蛾结节反应的调控。(3)菌清除能力检测:敲降组斜纹夜蛾血淋巴中金黄色葡萄球菌含量明著高于对照组,表明干扰后斜纹夜蛾血淋巴对菌的清除能力降低了。上述体外功能实验和RNA干扰实验结果显示Noduler基因可能通过介导酚氧化酶原激活反应和结节反应从而在斜纹夜蛾先天性免疫反应中发挥着重要的作用。
【学位授予单位】:华中师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;S433.4

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1 胡巧巧;斜蚊夜蛾Noduler基因的功能研究[D];华中师范大学;2017年
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