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《华中师范大学》 2001年
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粉纹夜蛾BTI-Tn-5B1细胞对苏云金芽孢杆菌cryIA(c)毒素的抗性选择及抗性机制的初步研究

郑丙莲  
【摘要】: 本文在总结前人以苏云金芽孢杆菌工业制剂筛选培养的昆虫细胞来研究其抗 性发生、发展规律的基础上,为了进一步探讨单一的杀虫晶体蛋白诱导昆虫细胞 产生抗性的规律和深入研究其抗性机制,我们以在大肠杆菌中表达的CryIA(c)毒 素连续处理离体培养的粉纹夜蛾BTI-Tn-5B1细胞,目前已获得一株对CryIA(c)毒 素产生较高抗性的细胞系,并从细胞膜上受体蛋白水平进一步探讨了其抗性产生 的原因。主要结果如下: 1.CryIA(c)毒素在大肠杆菌BL21中的克隆与表达 将携带有CryIA(c)编码基因的重组质粒pUC19载体克隆到大肠杆菌BL21菌 株中,扩大培养。将纯化的杀虫晶体蛋白以50mM Na_2CO_3(pH10.5)溶液降解后处 理八种培养的昆虫细胞发现,CryIA(c)毒素对粉纹夜蛾细胞、小菜蛾细胞等大多 数鳞翅目昆虫细胞都有毒效,而同样方法提纯的大肠杆菌蛋白质对上述细胞完全 没有毒力。同时克隆了CryIA(c)晶体编码基因的大肠杆菌培养物经超薄切片,电 镜下也观察到了菱形、立方形晶体的形成,该晶体与在苏云金芽孢杆菌中形成的 伴胞晶体比较,只是相对小些。并且,将纯化的杀虫晶体蛋白以50mM Na_2CO_3(pH10.5)溶液降解后经SDS-PAGE电泳分析,结果显示,有毒性多肽 (MW66KD左右)的存在,而对照的大肠杆菌中没有该毒蛋白的存在。 2.抗性粉纹夜蛾细胞系(R-Tn-5B1)的筛选及其抗性测定 离体生测结果表明,粉纹夜蛾Tn-5B1细胞对CryIA(c)毒素最敏感,其LC_(50) 值只有45.2μg/ml。继而用CryIA(c)毒素连续处理Tn-5B1细胞,以MTT法每5 代测定其抗性上升情况。发现相对于苏云金芽孢杆菌工业粉剂来说,单一杀虫晶 体毒素比用工业粉剂筛选确实更易使昆虫细胞产生抗性。同样的处理,以CryIA(c) 毒素筛选的Tn-5B1细胞至第26代时抗性已达1232倍,而以工业粉剂GC-91(含 卜二塞善弓。1 扦+上十乃;H十 \·。、~/V>S了三三S 丁HESIS 多种混合毒素)筛选的Tn5BI细胞至第25代时,抗性比只有10倍。且在无C ryIAryIAO) 毒素存在的环境中传代发现,细胞水平的抗性衰退比活体昆虫对毒素的抗性衰退 要慢得多,且抗性越高,其稳定性越好。经过20代的无p C)毒素培养基中连 续传代,第 15 ’WM’*性细胞的抗性比已由 675降至 6.3,而第 28代抗性细胞的抗性 比由1134降至381。 3.抗性8川-T。sin细胞膜上受体蛋白的研究 序 分别以离心纯化的方法制备第26代抗性粉纹夜蛾细胞和敏感粉纹夜蛾细胞的 细胞膜蛋白粗提物,溶解后SDS-PAG电泳结果显示,抗性细胞的膜蛋白在约 37KDa处明显缺失一条带,而敏感细胞的相应处的蛋白带非常明显。进一步的配 体杂交实验(Ligand blot)结果表明,两者在与 CryIAk)毒素结合方面存在明显差 异。在敏感细胞膜制备物中存在两个结合位点,分子量分别为34KDa、37KDa, 而在抗性细胞膜制备物中只有一个与p C)毒素结合的位点,推测37KDa受体 蛋白的缺失或浓度的降低是导致粉纹夜蛾 Tn5B细胞对 CryIAk)毒素产生抗性的 直接原因。
【学位授予单位】:华中师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S433.4;S476.1

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