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《华中师范大学》 2002年
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根癌农杆菌介导的甜蛋白thaumatin基因导入烟草的遗传转化研究

杨成丽  
【摘要】: 甜蛋白Thaumatin是一种高甜度、低热量、安全无毒、甜味纯正的非糖类新型甜味剂,具有很高的经济价值。然而该蛋白的来源植物只产于西非Thaumatococcus danielli的果实中,该植物对生活环境要求苛刻,在世界各地的引种尚不成功,不能满足人们对甜蛋白Thaumatin的大量需求。研究人员试图用微生物表达甜蛋白,结果不如人意。因此,本试验构建了植物表达载体pBI_(121)-th,并将其转入根癌农杆菌LBA_(4404)中,然后通过农杆菌的介导将thaumatin基因导入烟草中,并对转基因植株进行了检测,借以初步探讨甜蛋白在植物中的转化和表达情况,为其今后在更多的植物上应用提供依据。实验结果如下: 1.甜蛋白thaumatin基因植物表达质粒pBI_(121)-th的构建与鉴定 利用DNA重组技术,将植物甜蛋白thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI_(121)中,通过酶切、电泳,鉴定thaumatin基因已成功构建到植物表达质粒pBI_(121)中。 2.pBI_(121)-th质粒转化根癌农杆菌 重组质粒pBI_(121)-th通过直接转化法导入农杆菌LBA_(4404)中,卡那霉素(Km)平板筛选阳性克隆,有单菌落生长,证明重组质粒已转进农杆菌LBA_(4404)中。 3.植株再生体系的建立 采用无菌苗烟草叶片为外植体,以MS为基本培养基,筛选出MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L以诱导不定芽的分化,并于MS+NAA0.3mg/L的 PA 硕士学位论文 V沉了砂 “工队nk” 主根培养基上生根,获得完整再生植株。其叶片分化率达65石%,生根率达 95%。 4.转化体筛选及植株再生 将预培养2天的外植体与农杆菌菌液浸染5~6分钟后,共培养2~3天, 然后转化到含Km75m旮 的选择培养基上进行分化筛选,再转入K。为 75mg几、100mg/L的培养基上进行生根筛选,生根率为82.5%。转入外源基 因的转化体将会在这一系列筛选过程中发芽、生根,获得转基因植株。 5.转基因PCR检测 PCR扩增 nPt 11基因,证明 thaumatin基因己导入烟草中,转化率为 引.3%c
【学位授予单位】:华中师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q943.2

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