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《华中师范大学》 2008年
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重组苏云金芽孢杆菌丙酮酸脱氢酶表达条件的优化及结构预测

李艳  
【摘要】: 丙酮酸脱氢酶复合体(PDHc)是焦磷酸硫胺素依赖型多酶体系,广泛存在于原核生物和真核生物中。PDHc复合体催化丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA,乙酰CoA进入三羧酸循环被彻底的氧化分解,为生物体的生命活动提供必要的能量。丙酮酸脱氢酶(El)是催化丙酮酸氧化脱羧反应的第一个酶,其催化的反应是整个反应过程中唯一的不可逆步骤,其活性一旦受抑制,则有氧代谢受阻,生物体的代谢活动受到影响。鉴于丙酮酸脱氢酶在代谢中的重要作用,研发以丙酮酸脱氢酶为靶标、具有低毒的抑制剂,将会为抑制剂的研究打开一个全新领域。本研究试图为筛选出以丙酮酸脱氢酶为靶标的杀菌剂提供充足的酶制剂。 本课题组在前期工作中已经在大肠杆菌中成功表达了苏云金芽孢杆菌丙酮酸脱氢酶,但表达产物主要以没有生物活性的包涵体形式存在。本研究通过对宿主菌的表达条件(培养基组成,培养基的pH值,菌体密度,诱导剂浓度,诱导温度和诱导时间)进行优化进而获得有生物活性的重组酶。一般的表达条件是使用pH值为7.2的LB培养基,从培养液菌体密度0.6起,在37℃下,使用终浓度1mmol/L的IPTG诱导3小时。在此条件下所表达的可溶目的蛋白为0.945mg/每100mL培养液,活力为0.09U。表达条件进行优化后,结果表明使用pH值6.0~7.5的TB+M9(体积1:1)培养基,从培养液菌体密度4-4.5(O.D_(600))起,在21℃下,使用终浓度0.04mmol/L的IPTG诱导8小时可使可溶的苏云金芽孢杆菌丙酮酸脱氢酶在大肠杆菌中表达量达到5.52mg/每100mL培养液,活力为0.272U。前后条件相比,表达条件优化后,可溶的目的蛋白含量增长484%,活性提高近200%。通过亲和层析,每100mL培养液可获得0.168mg重组酶。与重组酶在pH7.0缓冲液中的活性相比,重组酶在pH6.6的缓冲液中有125 9/6的相对活性;重组酶的V_(max)是16.34μmol/min,K_m2.14mmol/L。 在获得重组苏云金芽孢杆菌丙酮酸脱氢酶的基础上,对同源性进行了分析。NCBI BLAST显示,与蜡状芽孢杆菌丙酮酸脱氢酶有高达99%的同源性,和枯草芽孢杆菌丙酮酸脱氢酶、嗜热脂肪芽孢杆菌丙酮酸脱氢酶的同源性也在80%以上。二级结构预测的结果显示α亚基中卷曲占45.45%,折叠占11.23%,β亚基中卷曲占43.87%,折叠占16.56%。对α亚基和β亚基的亲/疏水性分析显示,α亚基是亲水性肽链,而β亚基是疏水性肽链。Motif分析和预测显示,苏云金芽孢杆菌丙酮酸脱氢酶可能含有磷酸化位点,豆蔻酰化位点,酰胺化位点和粘多糖结合位点。
【学位授予单位】:华中师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S482.2

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