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光温敏核不育系HD9802S候选不育基因的amiRNA双元表达载体构建与遗传转化

邹小维  
【摘要】:光温敏核不育水稻是一种重要的种质资源,目前已知光温敏核不育基因分布广泛,在不同的光温敏核不育系中差异较大。籼型温敏核不育系HD9802S的育性受一对主效隐性基因控制,被定位于水稻第二号连锁群上的SSR分子标记RM5897和RMAN8之间的46.5kb范围内,该基因暂命名为HDtmS。 围绕该不育基因,本研究做了以下4个方面的工作:①在BGI Rise Genome Database数据库中检索位于该区间的序列(编号为Scaffold002359),并通过Fgenesh软件对Scaffold002359序列预测了3个基因共7个ORF,利用在线设靶软件共选择了21个靶位点。②以miR528天然结构为基础,利用一步PCR反扩法将21个靶位点替换miR528的茎序列,而侧翼及环结构不变,从而获得含有目的表达单元的供体载体(pDONOR-HDtms),再通过MAGIC方法将供体载体与受体载体(p1301-gfp)接合,从而获得amiRNA (Artificial microRNA)双元表达载体。③通过遗传转化,获得再生植株。④利用PCR技术检测组培苗,将阳性植株移栽至大田,通过Southern blot检测田间转基因植株的拷贝数,观察部分植株的花粉育性并统计结实率。 现已获得7个amiRNA载体的转基因阳性植株,分别为p528-3、p528-6、 p528-8、p528-10、p528-15、p528-18、p528-19。其中以上靶位点分别获得转基因植株8、4、6、6、5、5、4株。PCR及Southern blot检测表明目的表达单元已成功导入籼稻9311中;而花粉育性检测试验表明:p528-8阳性植株花粉大都不育,结实率也很低。


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