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《湖北大学》 2017年
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地衣芽胞杆菌蛋白酶高效表达及在大豆肽酶解工艺中的应用

师璐  
【摘要】:大豆肽是由大豆蛋白经水解产生的具有多功能活性的低分子肽,分子量低于1000 Da。由于其具有良好的水溶性、强的吸湿保湿性和低黏度性,因此被广泛用于食品、医药、化妆品及饲料行业。目前制备大豆肽的主要方法有化学水解法、微生物发酵法和酶解法,其中酶法制备大豆肽已成为主流方法。酶解法所需的酶通常来源于微生物发酵,而微生物发酵产生的酶活往往较低,导致大豆肽得率偏低,限制了酶解法在工业生产中的应用。本研究通过代谢工程改造及发酵工艺优化显著提高了地衣芽胞杆菌表达蛋白酶的能力,并通过优化酶解工艺,提高了大豆肽的制备效率。主要研究结果如下:1.本研究选取四个蛋白酶基因为候选酶基因,并以实验室保存的异源蛋白表达宿主菌BL10为宿主,以P43启动子为启动子,分别构建了四种蛋白酶表达菌株,BL10/p P43-aprE、BL10/pP43-bprA、BL10/pP43-epr和BL10/pP43-vpr。通过蛋白酶活力测定,酶活力大小为BL10/pP43-aprE(18.41 U/m L)BL10/pP43-bprA(17.36)BL10/pP43-epr(14.02 U/mL)BL10/p P43-vpr(10.26 U/m L)。结果表明,AprE在地衣芽胞杆菌中具有高效的胞外蛋白酶活性,因此以AprE为目标蛋白用于后续的研究。2.宿主菌的筛选。在确定了酶蛋白基因的基础上,分别以地衣芽胞杆菌DW2、DW2ΔbacA、WX-02及BL10为宿主,研究了宿主菌对酶蛋白表达的影响,结果表明:以DW2ΔbacA为宿主菌时蛋白酶活力最高,为21.00 U/m L。3.启动子是影响蛋白质高效表达的重要因素之一。本研究选取了3个强启动子,分别为杆菌肽基因簇启动子P_(bacA)、碱性蛋白酶AprE自身启动子P_(aprE)以及经P43启动子改造后的启动子P_(RBS6)进行启动子的筛选。分别用上述三个启动子成功构建了不同启动子蛋白酶工程菌。并以菌株ΔbacA/pP43-aprE作为对照。结果表明:以P_(RBS6)为启动子能够显著提高蛋白酶的表达,其蛋白酶活力提高至69.40 U/mL,比ΔbacA/pP43-aprE菌株提高了2.65倍。4.信号肽对外源蛋白的分泌具有重要的影响。本研究分别选取丝氨酸蛋白水解酶信号肽SP_(Vpr)、甘露聚糖酶信号肽SP_(SacB)、SP_(SacC)和AprE自身信号肽SP_(aprE),成功构建了不同信号肽蛋白酶表达菌株。结果表明,在SP_(Vpr)、SP_(SacB)和SP_(SacC)信号肽下的蛋白酶活分别为47.40 U/m L、32.80 U/m L和37.90 U/m L,均低于SP_(aprE)信号肽介导下的蛋白酶77.93 U/m L。因此,本研究最终得到了工程菌株地衣芽胞杆菌ΔbacA/pP_(RBS6)SP_(aprE)-aprE。5.发酵工艺优化。本研究以ΔbacA/pP_(RBS6)SP_(aprE)-aprE工程菌为研究对象进行摇瓶发酵工艺优化。首先进行了单因素实验,确定了产酶过程中最优的玉米淀粉(40 g/L)、豆粕(60 g/L)和硫酸铵(3 g/L),并通过培养基正交工艺优化,得到培养基最佳搭配;在此基础上,对该菌株进行培养条件的优化,分别从种龄、接种量及装液量进行优化,并通过正交工艺确定了培养条件的最佳搭配。发酵工艺优化后的培养基主要成份组成为:玉米淀粉40 g/L、豆粕70 g/L、硫酸铵2 g/L、轻钙1 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、不添加玉米浆。优化后的最佳培养条件组成为:种龄6 h-8 h、接种量(v/v)4%、装液量25 m L。发酵工艺优化后蛋白酶活力达到了747.40 U/mL。6.豆粕酶解制备大豆肽的应用。以豆粕为原材料,分别优化了料水比、酶液添加量和酶解时间。经过上述测定,本研究得出最优酶解工艺条件为:将豆粕与水按照5:10的比例混合、酶解8 h、添加3%的蛋白酶液,此时,大豆肽中蛋白表达及抗营养因子去除情况均为最优。
【学位授予单位】:湖北大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ925;Q78

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