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《湖北大学》 2017年
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CG10483基因高表达及功能缺失突变体果蝇品系的构建

李博  
【摘要】:原发型家族性脑钙化(Primary familial brain calcification,PFBC)是一种极为少见家族性常染色体显性遗传病,钙化可能发生于大脑的豆状核、尾状核、脑丘、齿状核等部位。患者多在30-60岁之间发病,临床表现包括肌张力障碍,帕金森症,运动失调,精神错乱,痴呆,舞蹈病和认知紊乱等。目前已知的PFBC的四个致病基因分别为SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1。之前的研究显示,SLC20A2基因是PFBC的主要致病基因。统计显示,SLC20A2中超过50个位点的突变都会引起PFBC发生,在对该病患者的检测中,41%的家族性PFBC患者和14%的散发性PFBC患者均能够检测到该基因突变。XPR1基因是最近一个新发现的能引起基底节钙化的基因,最早是作为逆转录病毒的受体被发现的。最初的研究认为XPR1基因编码的蛋白是异嗜性小鼠白血病病毒受体,但是后来研究发现这个蛋白具有磷酸盐输出功能。通过生物信息学方法预测XPR1基因编码的蛋白有8个跨膜区、3个胞质区和4个胞外区,其中蛋白的N端和C端都在细胞内,分别包含一个SPX结构域和一个EXS结构域。SPX结构域在进化过程中比较保守,现在含有SPX结构域的蛋白质在许多真核生物中都有发现,Legati等在PFBC患者中鉴定的6个XPR1基因突变中的4个均位于SPX结构域。本实验室之前的研究大部分围绕着PFBC的主要致病基因SLC20A2,研究其在果蝇体内的同源基因CG42575,并取得一定的进展。CG10483是XPR1在果蝇体内的同源基因之一,定位于果蝇的三号染色体上,主要在神经系统中表达。CG10483与XPR1基因的同源性达到了55%,二者的SPX结构域也有很高的相似性,为我们以果蝇为模型探究XPR1基因的具体功能及其在磷酸盐稳态中的作用提供了可能。同时,CG42575与CG10483基因表达位置的相似,功能上的互补,也为我们多方面剖析果蝇细胞磷酸盐稳态提供了思路。本实验以模式生物果蝇为材料,使用时下最新的基因改造技术CRISPR/Cas9系统,构建CG10483基因的无功能突变体。将引导Cas9内切酶的sgRNA的表达载体注射到生殖腺特异性表达Cas9酶的果蝇中,不仅操作简单,试验周期短,且成功率高。同时,使用P因子插入和位点专一性重组技术,在果蝇的二号染色体上定点插入CG10483基因的CDS序列。使用的pUASTattB载体上带有white报告基因,成功转基因的果蝇的眼色会由浅粉色变为红色,方便了后续转基因果蝇的筛选。同时,该载体上还带有UAS(upstream active sequence)上游激活序列,可以通过不同的GAL4(GAL,actose—regulated upstream promoter element,GAL半乳糖调节上游启动子元件)驱动表达,不仅仅能够挽救CG10483基因的缺失型果蝇,也可以通过不同位置表达的GAL4来驱动CG10483基因发挥功能,从而确定CG10483基因编码的蛋白的作用位置。本实验构建的两种转基因果蝇,为进一步研究CG10483基因的功能及其蛋白定位提供了有力的工具,也为探究果蝇细胞内磷酸盐的稳态提供了有力的帮助。
【学位授予单位】:湖北大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R742

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1 李博;CG10483基因高表达及功能缺失突变体果蝇品系的构建[D];湖北大学;2017年
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