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点突变对精氨酸激酶构象变化影响的研究

刘娜  
【摘要】:精氨酸激酶(Arginine kinase, AK)在无脊椎动物细胞的能量代谢中承担着重要功能,通过催化ATP和精氨酸间磷酸基团的可逆转化来平衡胞内ATP浓度。本文以来源于刀额新对虾的精氨酸激酶(40 kDa)为模式蛋白,利用定点突变技术研究蛋白质构象的变化。 本文通过反向PCR法将62号Asp突变为Gly和Glu,将193号Arg突变为Gly和Lys,将271号Cys突变为Ala和Ser。带有6个组氨酸标记的突变体和野生型AK,均在大肠杆菌Rosetta中实现了可溶性表达,通过镍亲和层析柱进行了纯化,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测都达到了电泳纯。 D62与R193对精氨酸激酶活性和结构稳定性的影响。第62,193号氨基酸残基在单亚基AK中高度保守,且在过渡态类似物中形成一对电子对。酶活性检测显示突变体D62E和R193K仍保留了野生型精氨酸激酶90%的活性,而D62G和R193G则丧失了大部分的活性。本实验利用荧光光谱法比较了野生型与突变体AK间物理化学性质以及构象的差异,结果显示突变体AK构象都有变化,并且在脲溶液中的稳定性也降低了。我们推断D62与R193间的氢键作用和静电相互作用,在精氨酸激酶的结构稳定性和介导底物结合协同性上有重要的作用。 Cys271对精氨酸激酶构象变化的影响。利用酶活力测定,紫外差光谱法,荧光光谱法以及分子筛排阻层析法比较了野生型与突变体AK间物理化学性质以及构象的差异。结果显示:突变体活性几乎完全丧失,底物(精氨酸-ADP-Mg~(2+))可以诱导突变体和野生型AK构象的变化,NO3ˉ也同样可以诱导酶的构象作进一步变化。结果暗示:Cys271可能处在精氨酸激酶两个结构域间的铰链区,引导酶与底物结合后正确的构象变化。


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