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基于定点突变技术的精氨酸激酶结构与功能的研究

石玉林  
【摘要】:本文研究的是greasyback shrimp (Metapenaeus ensis)精氨酸激酶ArginineKinase(ATP:arginine N-phosphotransferase,EC2.7.3.3,简称AK),它是一种磷酸原激酶,主要存在无脊椎动物细胞中,对其能量代谢起着重要的缓冲作用,它是一个由分子量为40KD的单亚基构成。 本文利用反向PCR将野生型AK基因进行定点突变,得到了中国对虾精氨酸激酶的八种突变体: Asp226Glu(D226E)、 Asp226Asn(D226N)、Asp226Ala(D226A)、Tyr89Phe(Y89F)、Tyr89Asp(Y89D)、Arg330Lys(R330K)、Arg330Lue(R330L)和Tyr89Phe/Arg330Lue(Y89F/R330L),并且在E.coli Rosetta中均实现了可溶性表达,因为这8个突变体和野生型AK都带有6个His标签,因此采用镍亲和层析法获得了较高电泳纯的目标蛋白。 226号位的Asp是位于“NEEDH”一段高度保守的负电荷密集区中,这段区域的酶的催化反应中起着重要的作用。通过酶的活性测定显示只有突变体D226E保留了野生型AK9.8%的活性,并且它的K_m~(ATP)和K_m~(Arg)较野生型AK都所有增大,而突变体D226N和D226A几乎完全丧失了所有的活性。由荧光光谱和圆二色光谱比较了野生型与突变型AK间的构象差异,结果两者之间的构象变化较大,通过酶与底物结合的影响分析,显示突变体依然具有与结合诱导其构象变化的功能。因此推测226号位的Asp对AK的结构与功能稳定起着重要的作用。 89号位的Tyr与330号位的Arg分别位于AK N端结构域与C端结构域高度保守的两个位点,并且是通过氢键将两者联系在一起的。通过酶的活性测定,荧光光谱法及酶的热稳定性分析比较了野生型与突变型AK之间的差异。其结果:突变体Y89F和R330K只分别保留野生型AK56.2%和23.4%的活性,其余的突变体几乎没有了活性,并且发现了在同样的纯化和储存条件下突变体R330K、R330L和双突变体Y89F/R330L很容易被氧化。突变体的构象与野生型的也有明显的差异,而且R330K的热稳定性最强,Y89F最弱。我们认为89Tyr与330Arg之间仅仅是通过氢键的相互作用来维持AK结构与功能的完整性。


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