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新型转基因标准物质与标记基因检测方法研究

岳运锋  
【摘要】:转基因筛查体系包括转基因检测标准物质和转基因检测方法。转基因筛查检测标准物质是转基因筛查体系的物质基础,转基因筛查检测方法是转基因筛查体系的技术基础。 鉴于制作基体型标准物质的转基因材料很难获得和质粒型标准物质容易污染检测环境,而且价格昂贵,本研究尝试研制一种既具有基体型标准物质和质粒型标准物质的优点又克服它们缺点的新型标准物质。通过把含有植物转基因通用元件以及油菜、玉米、水稻、甜菜、大豆和马铃薯的内标准基因的阳性质粒转入模式植物烟草,发展成为新型标准物质。用卡那霉素作为筛选选择压,获得了拥有卡那霉素抗性的阳性烟草植株。研究显示,转基因烟草含有所有转基因通用元件的检测靶标序列,可以较好充当转基因检测的阳性对照用于转基因成分的筛查工作。 本研究还分析了商业化转基因品种的分子特征与元件分布,选取应用频率高或在未来应用潜力大的标记基因NPTII、PAT、CP4-EPSPS、Bar、HPTII、GUS和PMI作为检测靶标,建立了这7个基因的普通PCR和实时荧光PCR检测方法。 本研究为转基因成分检测标准物质研制提供了一个全新的思路,首次研制成功基于转基因烟草的转基因筛查用标准物质,为克服现有标准物质的缺点提供了可能。本研究还在我国建立了筛选标记基因的PCR检测标准化体系,该体系已成为国家检测标准。 本研究取得以下主要研究结果: 1)克隆了6类农作物的10个内标准基因; 2)成功构建包括11个转基因通用元件和6类农作物的10个内标准基因的双元载体(阳性质粒)pBI-121RM; 3)获得含有外源靶标序列的转基因烟草; 4)完成转基因烟草在的替代性试验;证明新型标准物质在转基因筛查PCR检测中的替代性良好; 5)首次以植物筛选标记基因为靶标,建立了PCR检测方法;所建立的普通PCR和实时荧光PCR检测方法特异性好、灵敏度高、重现性好,适用于对农产品中的转基因成分进行大规模筛查检测。


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