水稻稻瘟病抗性基因Pita~2候选基因功能的初步分析
【摘要】：稻瘟病是水稻生产上最具毁灭性的病害之一,严重影响水稻产量。开展稻瘟病新抗性基因的鉴定和研究对抗病育种具有重要的实际意义。稻瘟病新抗性基因Pita~2比Pita抗谱更广,为抗稻瘟病育种提供了一个新的抗源。本研究在Pita~2精细定位和物理作图的基础上,为对该基因的候选基因进行了预测注释和表达分析,并且利用农杆菌介导的遗传转化对候选基因功能进行了初步的分析,主要结果如下:
1.利用公共数据库中日本晴的参考序列,通过生物信息学软件对目的基因区域进行了候选基因的预测注释,结果表明,在目的基因区域共有10个候选基因,其中有5个基因编码区仅100-200 bp,因此选择另外大小合适的5个基因作为该基因的候选基因,分别命名为:Pita~2-1,Pita~2-2,Pita~2-3,Pita~2-4,Pita~2-5。本研究进一步利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对Pita~2的这些候选基因进行了表达分析,结果表明,5个候选基因中有2个基因在稻瘟病菌接种前后均不表达的,可能是假基因,另外3个基因均表达,可能是有功能的基因。
2.将5个候选基因中能从抗病品种PiNo.4扩增出来的4个候选基因全长构建功能互补载体,并对感病品种日本晴进行遗传转化,对T0代的部分转基因植株进行稻瘟病菌研53-33孢子喷雾接种,结果发现Pita~2-2和Pita~2-5的转基因植株抗病性与是否转入插入片段没有直接联系,可能这两个候选基因并不是Pita~2的真实基因,继续鉴定其他候选基因来找出Pita~2。
3.依据三个表达的基因设计引物,并构建干涉载体Pita~2-1RI、Pita~2-3RI、Pita~2-4RI,通过遗传转化转入抗病品种PiNo.4中。在T0代转基因植株中,苗期经PCR鉴定为阳性的植株,难易成活,未能得到T1代种子。对Pita~2-1、Pita~2-3、Pita~2-4干涉的水稻植株易于在生长早期死亡,尚待进一步证实。
【关键词】：稻瘟病 Pita~2 RNA干涉 功能互补 【学位授予单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S511
【目录】：
- 摘要8-9
- ABSTRACT9-10
- 第一章 文献综述10-22
- 1.1 稻瘟病抗性基因研究的意义10
- 1.2 稻瘟病抗性基因研究的进展10-19
- 1.3 植物抗病基因的结构特点以及可能的抗性机制19-21
- 1.3.1 植物抗病基因的结构特点19-20
- 1.3.2 植物抗性基因抗性反应的识别机制20-21
- 1.3.2.1 基因对基因假说20
- 1.3.2.2 警卫假说20-21
- 1.4 本研究的内容及意义21-22
- 第二章 稻瘟病抗性基因Pita2候选基因预测与表达分析22-27
- 2.1 引言22
- 2.2 材料与方法22-24
- 2.2.1 实验材料22
- 2.2.2 主要试剂22
- 2.2.3 分析软件22-23
- 2.2.4 表达分析23-24
- 2.3 结果24-25
- 2.3.1 候选基因的预测24
- 2.3.2 候选基因的表达分析24-25
- 2.4 讨论25-27
- 第三章 稻瘟病抗性基因Pita2候选基因功能互补载体的构建与遗传转化27-43
- 3.1 引言27
- 3.2 材料与方法27-30
- 3.2.1 植物材料27-28
- 3.2.2 载体与菌株28
- 3.2.3 主要试剂28-29
- 3.2.4 主要仪器设备29
- 3.2.5 主要培养基的成分及其制备方法29-30
- 3.3 实验方案30-38
- 3.3.1 Pita~2 候选基因的克隆30-34
- 3.3.1.1 Pita~2 候选基因扩增30-31
- 3.3.1.2 琼脂糖凝胶电泳检测31
- 3.3.1.3 PCR 产物回收31-32
- 3.3.1.4 目的片段的酶切32
- 3.3.1.5 酶切产物的纯化32
- 3.3.1.6 功能互补载体pCAMBIA1300 质粒DNA 的制备32-33
- 3.3.1.7 载体质粒的酶切、去磷酸及其产物的纯化33
- 3.3.1.8 目的片段与载体质粒DNA 的连接33
- 3.3.1.9 连接产物热激转化大肠杆菌细胞及阳性克隆的鉴定和保存33-34
- 3.3.2 根癌农杆菌EHA105 热激感受态细胞的制备、转化与鉴定34-35
- 3.3.2.1 制备农杆菌EHA105 热激感受态细胞34-35
- 3.3.2.2 重组载体质粒DNA 热激转化农杆菌感受态细胞35
- 3.3.2.3 阳性克隆的鉴定和保存35
- 3.3.3 农杆菌介导的遗传转化35-36
- 3.3.3.1 水稻胚性愈伤组织诱导和预培养35
- 3.3.3.2 农杆菌的活化及悬浮35-36
- 3.3.3.3 愈伤组织的农杆菌侵染及共培养36
- 3.3.3.4 抗性愈伤组织的筛选及分化36
- 3.3.3.5 幼苗的生根和移栽36
- 3.3.4 T_0 代转基因水稻的分子检测36-37
- 3.3.4.1 植物基因组DNA 快速小量提取36-37
- 3.3.4.2 Hpt 基因的PCR 检测37
- 3.3.5 T_0 代转基因水稻人工辅助接种37-38
- 3.3.5.1 真菌培养基的配制37
- 3.3.5.2 稻瘟病菌研53-33 的培养与产孢37-38
- 3.3.5.3 稻瘟病菌人工辅助接种38
- 3.4 结果38-42
- 3.4.1 Pita~2 候选基因功能互补载体的构建38-39
- 3.4.2 水稻遗传转化与转基因植株的获得39-40
- 3.4.3 T_0 代转基因水稻DNA 水平的PCR 检测40-41
- 3.4.4 Pita~2 候选基因功能互补载体转基因水稻T_0 代接种结果41-42
- 3.5 讨论42-43
- 3.5.1 关于功能互补载体的构建42
- 3.5.2 农杆菌介导的水稻遗传转化42-43
- 第四章 稻瘟病抗性基因Pita~2候选基因干涉载体的构建与遗传转化43-52
- 4.1 引言43
- 4.2 材料与方法43-44
- 4.2.1 植物材料43
- 4.2.2 载体与菌株43-44
- 4.2.3 主要试剂44
- 4.2.4 主要仪器设备44
- 4.2.5 主要培养基的成分及其制备方法44
- 4.3 实验方案44-48
- 4.3.1 Pita~2 候选基因干涉载体的构建44-47
- 4.3.1.1 水稻总RNA 的提取44-45
- 4.3.1.2 PiNo.4 cDNA 第一链的合成45-46
- 4.3.1.3 干涉片段的引物设计46
- 4.3.1.4 干涉片段的PCR 扩增46
- 4.3.1.5 PCR 产物回收、酶切及纯化46
- 4.3.1.6 Gateway 技术Topo 试剂盒入门载体的BP 反应46-47
- 4.3.1.7 干涉载体pANDA 质粒DNA 的制备47
- 4.3.1.8 Gateway 技术LR 反应干涉载体的构建47
- 4.3.1.9 目的片段与载体质粒DNA 的连接47
- 4.3.1.10 连接产物热激转化大肠杆菌细胞及阳性克隆的鉴定和保存47
- 4.3.2 农杆菌介导的遗传转化47
- 4.3.3 转基因水稻的分子检测47-48
- 4.3.3.1 植物基因组DNA 快速小量提取47
- 4.3.3.2 guslinker 的PCR 检测47-48
- 4.4 实验结果48-50
- 4.4.1 Pita~2 候选基因干涉载体的构建48-49
- 4.4.2 水稻遗传转化与转基因植株的获得49
- 4.4.3 T_0 代转基因水稻DNA 水平的PCR 鉴定49-50
- 4.5 讨论50-52
- 参考文献52-62
- 致谢62-63
- 硕士在读期间发表的论文63
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