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《中南民族大学》 2015年
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Complexin蛋白调控囊泡分泌机制研究

李小红  
【摘要】:高度保守的Complexin(Cpx)蛋白是一类主要存在于真核生物神经系统中的小分子蛋白家族,它能够参与调控突触囊泡的分泌。Cpx蛋白能够与SNARE复合体结合,固定SNARE复合体的结构。在Ca2+存在的情况下,囊泡转运蛋白Synaptotagmin会取代Cpx与SNARE复合体结合,他们之间的相互作用使得融合孔开放,调控神经递质释放。本文分别从体内和体外两个方面,研究了Cpx蛋白调控囊泡分泌的分子机制,有助于我们从整体上了解囊泡分泌过程。Cpx蛋白能够抑制自发性神经递质释放,促进Ca2+促发的突触囊泡膜融合。虽然有许多针对Cpx蛋白功能及分子机制的研究,然而Cpx蛋白C末端的功能和分子作用机制一直没有被人们研究清楚,为此我们通过体外模拟突触囊泡膜融合情况,研究了Cpx蛋白C末端在质膜囊泡(plasma membrane vesicle,PM)与突触囊泡(synaptic vescile,SV)间相互作用、囊泡的自发性融合和Ca2+促发的囊泡融合的过程中的功能与作用机制。我们发现野生型Cpx-1(Complexin-1 wild type,CpxWT)能够促进囊泡间的连接、抑制自发性膜融合、促进Ca2+促发的囊泡膜融合,而中心α-螺旋结构域的突变体(Cpx-1 4M mutant,Cpx4M)破坏了SNARE复合体的形成,失去了它在囊泡膜融合过程中的所有功能。在去除C末端的情况下,Cpx促进囊泡间的连接和抑制自发性膜融合的功能消失了,但是仍能促进Ca2+促发的囊泡膜融合,说明Cpx蛋白的C末端能够促进囊泡间的连接和抑制自发性囊泡膜融合,但对Ca2+促发的囊泡膜融合无影响。进一步研究发现即使Cpx-1 C末端缺失突变体Cpx1-86溶液的浓度低于囊泡膜融合所需的最低浓度(30n M)时,也能够抑制PM-SV囊泡间的相互作用,Cpx1-86浓度的变化对自发性囊泡膜融合没有影响;Cpx1-86浓度在100-500 n M时,依然能促进Ca2+促发的囊泡膜融合,说明Cpx1-86与t-SNAREs之间存在着某种相互作用,能够阻止t-SNARE与v-SNARE或Synaptotagmin-1间的结合。接着我们发现优先将Cpx与PM囊泡结合,其实验结果与Cpx1-86的数据类似,囊泡结合受阻、自发性抑制功能消失;而优先将Cpx与SV囊泡结合,Cpx的功能与CpxWT类似,我们推测Cpx的C末端可能优先与囊泡膜结合。接着我们想在体内证实这一猜想。我们利用病毒侵染以及RNA干扰技术,将Cpx蛋白的突变体整合到原代培养的小鼠海马神经元细胞中,通过全细胞膜片钳技术记录录微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic currents,m EPSC)和诱发兴奋性突触后电流(evoked-EPSC),我们发现Cpx蛋白knockdown后,不能够抑制囊泡的自发性膜融合,但降低了Ca2+促发的囊泡膜融合效率,囊泡锚定蛋白Cpx-11-86-CSPα能够恢复Cpx蛋白的抑制功能,而与细胞质膜结合蛋白Cpx-11-86-CAIM不能恢复这一功能,囊泡锚定蛋白Cpx-11-86-CSPα与细胞质膜结合蛋白Cpx-11-86-CAIM都能够恢复Cpx蛋白对Ca2+促发的囊泡膜融合的促进作用。体内的实验结果证实我们的猜想,Cpx蛋白的C末端只有优先与突触囊泡膜结合才能实现其功能的完整性。
【关键词】:Complexin SNARE复合体 单囊泡融合技术 电生理
【学位授予单位】:中南民族大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R338
【目录】:
  • 摘要7-9
  • ABSTRACT9-11
  • 第1章 绪论11-21
  • 1.1 囊泡分泌相关蛋白11-15
  • 1.1.1 囊泡分泌的核心蛋白 -SNARE复合体12
  • 1.1.2 Ca~(2+)感受器-Synaptotagmin12-14
  • 1.1.3 Sec1/Munc-18(SM)蛋白14-15
  • 1.2 Complexin蛋白简介15-18
  • 1.2.1 Complexin蛋白的分类及分布15-16
  • 1.2.2 Complexin蛋白的结构16
  • 1.2.3 Complexin蛋白的功能域16-18
  • 1.3 囊泡膜融合及循环机制18-20
  • 1.3.1 SNARE复合体的形成19
  • 1.3.2 SNARE复合体的解聚19-20
  • 1.4 本文的研究目的和意义20-21
  • 第2章 实验原理和研究方法21-27
  • 2.1 RNA干扰技术21-23
  • 2.2 慢病毒侵染23-24
  • 2.3 膜片钳技术24-25
  • 2.4 单囊泡融合技术25-27
  • 第3章 Complexin蛋白的C末端在囊泡膜融合中的作用27-36
  • 3.1 引言27
  • 3.2 实验材料27-29
  • 3.2.1 菌株27
  • 3.2.2 试剂,耗材27-28
  • 3.2.3 常用溶液配制28-29
  • 3.3 实验方法29-32
  • 3.3.1 蛋白表达29-30
  • 3.3.2 诱导表达蛋白样的处理30
  • 3.3.3 蛋白纯化30-31
  • 3.3.4 蛋白重组31
  • 3.3.5 单囊泡融合技术31-32
  • 3.4 实验结果32-35
  • 3.4.1 Cpx-1 的C末端在囊泡融合中的作用32-33
  • 3.4.2 Cpx~(1-86)的浓度对囊泡融合的影响33-34
  • 3.4.3 Cpx与优先与突触囊泡膜结合34-35
  • 3.5 讨论35-36
  • 第4章 Complexin的C末端的分子作用机制36-48
  • 4.1 引言36
  • 4.2 实验材料36-39
  • 4.2.1 菌株,细胞株36
  • 4.2.2 试剂,耗材36-37
  • 4.2.3 常用溶液配制37-39
  • 4.3 实验方法39-43
  • 4.3.1 质粒构建39-40
  • 4.3.2 HEK293T细胞培养40
  • 4.3.3 HEK293T细胞包装病毒40-41
  • 4.3.4 常规离心浓缩慢病毒41
  • 4.3.5 小鼠海马神经元细胞原代培养41-42
  • 4.3.6 mini EPSC和evoked EPSC的记录42-43
  • 4.4 实验结果43-47
  • 4.4.1 Cpx-1~(1-86-CSPα)和Cpx-1~(1-86-CAIM)质粒构建43-44
  • 4.4.2 克隆蛋白表达鉴定44
  • 4.4.3 慢病毒侵染神经元44-45
  • 4.4.4 Cpx-1~(1-86-CSPα) 和Cpx-1~(1-86-CAIM)在自发性膜融合中的作用45-46
  • 4.4.5 Cpx-1~(1-86-CSPα) 和Cpx-1~(1-86-CAIM)在Ca~(2+)促发的膜融合中的作用46-47
  • 4.5 讨论47-48
  • 第5章 总结与展望48-50
  • 参考文献50-55
  • 致谢55-56
  • 附录 已发表的论文目录56

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