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《中南民族大学》 2015年
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Complexin蛋白调控囊泡分泌机制研究

李小红  
【摘要】:高度保守的Complexin(Cpx)蛋白是一类主要存在于真核生物神经系统中的小分子蛋白家族,它能够参与调控突触囊泡的分泌。Cpx蛋白能够与SNARE复合体结合,固定SNARE复合体的结构。在Ca2+存在的情况下,囊泡转运蛋白Synaptotagmin会取代Cpx与SNARE复合体结合,他们之间的相互作用使得融合孔开放,调控神经递质释放。本文分别从体内和体外两个方面,研究了Cpx蛋白调控囊泡分泌的分子机制,有助于我们从整体上了解囊泡分泌过程。Cpx蛋白能够抑制自发性神经递质释放,促进Ca2+促发的突触囊泡膜融合。虽然有许多针对Cpx蛋白功能及分子机制的研究,然而Cpx蛋白C末端的功能和分子作用机制一直没有被人们研究清楚,为此我们通过体外模拟突触囊泡膜融合情况,研究了Cpx蛋白C末端在质膜囊泡(plasma membrane vesicle,PM)与突触囊泡(synaptic vescile,SV)间相互作用、囊泡的自发性融合和Ca2+促发的囊泡融合的过程中的功能与作用机制。我们发现野生型Cpx-1(Complexin-1 wild type,CpxWT)能够促进囊泡间的连接、抑制自发性膜融合、促进Ca2+促发的囊泡膜融合,而中心α-螺旋结构域的突变体(Cpx-1 4M mutant,Cpx4M)破坏了SNARE复合体的形成,失去了它在囊泡膜融合过程中的所有功能。在去除C末端的情况下,Cpx促进囊泡间的连接和抑制自发性膜融合的功能消失了,但是仍能促进Ca2+促发的囊泡膜融合,说明Cpx蛋白的C末端能够促进囊泡间的连接和抑制自发性囊泡膜融合,但对Ca2+促发的囊泡膜融合无影响。进一步研究发现即使Cpx-1 C末端缺失突变体Cpx1-86溶液的浓度低于囊泡膜融合所需的最低浓度(30n M)时,也能够抑制PM-SV囊泡间的相互作用,Cpx1-86浓度的变化对自发性囊泡膜融合没有影响;Cpx1-86浓度在100-500 n M时,依然能促进Ca2+促发的囊泡膜融合,说明Cpx1-86与t-SNAREs之间存在着某种相互作用,能够阻止t-SNARE与v-SNARE或Synaptotagmin-1间的结合。接着我们发现优先将Cpx与PM囊泡结合,其实验结果与Cpx1-86的数据类似,囊泡结合受阻、自发性抑制功能消失;而优先将Cpx与SV囊泡结合,Cpx的功能与CpxWT类似,我们推测Cpx的C末端可能优先与囊泡膜结合。接着我们想在体内证实这一猜想。我们利用病毒侵染以及RNA干扰技术,将Cpx蛋白的突变体整合到原代培养的小鼠海马神经元细胞中,通过全细胞膜片钳技术记录录微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic currents,m EPSC)和诱发兴奋性突触后电流(evoked-EPSC),我们发现Cpx蛋白knockdown后,不能够抑制囊泡的自发性膜融合,但降低了Ca2+促发的囊泡膜融合效率,囊泡锚定蛋白Cpx-11-86-CSPα能够恢复Cpx蛋白的抑制功能,而与细胞质膜结合蛋白Cpx-11-86-CAIM不能恢复这一功能,囊泡锚定蛋白Cpx-11-86-CSPα与细胞质膜结合蛋白Cpx-11-86-CAIM都能够恢复Cpx蛋白对Ca2+促发的囊泡膜融合的促进作用。体内的实验结果证实我们的猜想,Cpx蛋白的C末端只有优先与突触囊泡膜结合才能实现其功能的完整性。
【学位授予单位】:中南民族大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R338

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