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《中南民族大学》 2015年
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细胞黏附蛋白的筛选

侯东梅  
【摘要】:人的大脑是人体最重要的器官之一,由数目巨大的神经元组成。神经元之间通过彼此相互接触完成信息的传递,从而实现接受刺激、传导兴奋的功能。神经元之间的信息传递是通过突触来完成的。突触是实现神经系统功能的基本结构单位。据统计,人体大脑中大约有1015个突触。突触由突触前膜、突触间隙和突触后膜组成。其中,突触间隙大约有20纳米,上面有各种功能各异的蛋白和碳水化合物分子,具有非常复杂的结构。突触间隙最重要的功能就是通过突触间隙上的蛋白质之间的相互作用,将突触前膜和突触后膜“粘连”起来,完成神经元之间的信息传递。这种蛋白我们称之为:细胞黏附蛋白。细胞黏附蛋白由三部分组成:与细胞骨架蛋白相连接的胞内结构域,跨膜结构域和与其它细胞黏附蛋白相互作用的胞外结构域。大多数细胞黏附蛋白位于突触中央,也有一些位于突触前膜和突触后膜反应区的边缘上。细胞黏附蛋白具有识别突触前膜和突触后膜的作用位点,传导神经信号,协助释放突触囊泡的功能。同时,细胞黏附蛋白分子对于突触的形成,成熟,分化,以及维持神经递质受体和离子通道的正常数量也起着至关重要的作用。突触细胞黏附蛋白的异常表达会导致各种神经系统疾病。目前,人类在神经系统疾病的发病率日益上升,已经成为威胁人类身体健康的最可怕的杀手之一。找到更多的细胞黏附蛋白并加强对其功能的研究,对于治疗神经系统疾病有着重要的意义。虽然发现了一些细胞黏附蛋白,但是与数目众多、种类各异的突触相比,我们知道的仅仅是冰山一角。有研究表明:细胞黏附蛋白在非神经元细胞上表达可诱发神经突触的聚集。缺失一种细胞黏附蛋白可能不会导致突触无法形成,但是却可以影响突触的结构和功能,甚至会导致神经系统疾病。基于上述结论,我们将神经细胞和非神经细胞共培养筛选出能诱发突触聚集的基因;通过基因的过表达或敲除实验对其功能进行研究从而发现细胞黏附蛋白。利用该方法可以发现更多的细胞黏附蛋白。我们对麻省理工大学Broad研究所和哈佛等著名高等院校研究所研发的最新的CCSB-Broad慢病毒表达文库进行了筛选。该文库是在该组织早先开发的ORFeome8.1文库的基础上,通过Gateway克隆的LR反应技术将目的基因转移到p LX304-Blast-V5载体上得到的。Gateway克隆技术是目前最先进的克隆技术之一,具有高效,快速,灵活的优点。由于CCSB-Broad慢病毒表达文库中缺少222个大小在3Kb以上的基因,因此在正式筛选前我们也采用Gateway克隆技术中的LR反应将缺少的目的质粒转移到p CDNA3.2v5-DEST载体上。LR反应是在Xis、IHF和Int等重组因子组成的LR重组酶混合物(LR Clonase?enzyme mix)的作用下将入门载体(Entry Clone)上的目的质粒ORF(open reading frame)与目的载体p CDNA3.2v5-DEST上的致死基因ccd B基因互换,得到p CDNA3.2v5-DEST载体上含有目的质粒的克隆产物的过程。酶切反应采用的是限制性内切酶Bgl II.只用一种限制性内切酶鉴定可以节约时间和成本。经过酶切验证,得到所有克隆正确的质粒。由于不能确定所有的LR克隆产物全都表达膜蛋白,在蛋白印迹实验中,验证的样品采用全蛋白。实验发现:对3.5厘米培养皿培养的HEK293T细胞来说,转染质粒在4微克可以达到最佳的转染效率。目前有110个LR克隆基因可以表达蛋白。通过LR克隆反应,我们得到几乎所有的人类基因,共有16394种,可以对人类全基因进行全面的筛选。本实验形成一套稳定的筛选方法。将1.5微克目的质粒和0.5微克GFP-FUGW质粒通过聚乙烯亚胺(PEI)转染到人源胚胎肾变种细胞(HEK293T)中培养24小时后加入培养九天的海马神经元中共同培养。36小时后免疫荧光染色再用高内涵细胞成像分析系统进行处理,如果目的质粒表达的蛋白为细胞黏附蛋白,就会诱导突触在HEK293T细胞周围聚集。实验中发现,转染0.25微克阳性质粒就可以引起明显的突触聚集现象。因此,本实验创新的将6中不同的质粒等浓度混合,再转染1.5微克混合质粒到HEK293T细胞中进行筛选。在达到筛选目的同时也节省了大量的时间和经费。实验用突触聚集荧光强度与周围突触荧光强度的比值来量化突触聚集程度,即Coculture Index(C.I.)值。C.I.1时可以观察到突触聚集现象。实验发现,突触聚集区域在HEK293T细胞边缘向内2微米,向外2微米得到的C.I.值较好。目前,实验筛选得到4个阳性混合质粒可能参与突触形成。
【关键词】:神经 突触形成 细胞黏附蛋白 LR克隆 共培养
【学位授予单位】:中南民族大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R338
【目录】:
  • 摘要7-9
  • ABSTRACT9-12
  • 第一章 绪论12-19
  • 1.1 细胞黏附蛋白的研究现状13-15
  • 1.2 研究方法15-18
  • 1.3 研究的目的和意义18-19
  • 第二章 LR克隆技术及其克隆质粒的验证19-36
  • 2.1 引言19
  • 2.2 GATEWAY克隆技术简介19-21
  • 2.3 实验方法21-31
  • 2.3.1 LR克隆反应21-23
  • 2.3.2 大肠杆菌扩大培养和质粒小提23-24
  • 2.3.3 酶切和琼脂糖凝胶电泳验证24-26
  • 2.3.4 蛋白验证26-31
  • 2.3.4.1 HEK293T细胞PEI转染26-27
  • 2.3.4.2 提取全蛋白27-28
  • 2.3.4.3 蛋白质印迹法28-31
  • 2.4 实验结果31-34
  • 2.4.1 酶切结果31-32
  • 2.4.2 蛋白印迹鉴定结果32-34
  • 2.5 结果分析34-36
  • 第三章 突触后膜细胞黏附蛋白的筛选36-53
  • 3.1 引言36
  • 3.2 高内涵细胞成像分析系统简介36-37
  • 3.3 实验方法37-42
  • 3.3.1 乳鼠海马组织神经细胞培养37-39
  • 3.3.1.1 乳鼠海马组织神经元提取37-38
  • 3.3.1.2 第一天神经细胞换神经元生长培养液38
  • 3.3.1.3 第四天神经细胞换含4微摩尔阿糖胞苷的神经元培养液38-39
  • 3.3.1.4 第九天神经细胞换含4微摩尔阿糖胞苷的神经元培养液39
  • 3.3.2 HEK293T细胞转染39-40
  • 3.3.2.1 第七天实验用HEK293T细胞培养39-40
  • 3.3.2.2 第八天HEK293T细胞PEI转染40
  • 3.3.3 第九天共培养40-41
  • 3.3.4 第十一天突触免疫荧光染色41-42
  • 3.4 实验结果42-51
  • 3.4.1 HEK293T细胞过量表达NL2也可以引起突触聚集42-43
  • 3.4.2 C.I.计算方法统计突触聚集程度43-44
  • 3.4.3 高内涵细胞成像系统图像采集44-45
  • 3.4.4 细胞共培养时间分析45
  • 3.4.5 转染质粒质量分析45-47
  • 3.4.6 突触蛋白筛选流程与结果分析47-50
  • 3.4.7 X1可以引起突触聚集现象50-51
  • 3.4.8 X1突触聚集数据分析51
  • 3.5 结果分析51-53
  • 第四章 结论与展望53-56
  • 4.1 LR克隆及其验证53-54
  • 4.2 细胞黏附蛋白筛选54
  • 4.3 展望54-56
  • 参考文献56-59
  • 致谢59-60
  • 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录60-61
  • 附录B 实验所需试剂的配置方法61-64

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