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《中南民族大学》 2015年
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水稻胞质不育相关蛋白ORF216的表达与潜在互作蛋白的验证

宋丹妮  
【摘要】:植物细胞质雄性不育(CMS)是指植物不能产生正常花粉而雌性生殖器官正常,其遗传符合母性遗传的现象。本实验室前期在红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)水稻中发现了一个新的胞质不育相关基因orf216,并获得了与该基因编码的蛋白发生潜在互作的蛋白。本实验分别构建胞质不育基因orfH79、潜在互作蛋白基因OsRPLx和OsATP5x的表达载体,诱导蛋白表达并通过蛋白互作实验研究它们与胞质不育蛋白ORF216的关系;培育不同水稻品种黄化苗,分离线粒体后提取相关蛋白,通过western blot实验检测胞质不育基因orf216的表达。主要取得了如下结果。1、对水稻胞质不育基因orf216和orfH79表达产物进行蛋白互作研究。分别诱导表达2个蛋白,通过western Blot分析,结果表明这2个不育基因产物没有发生直接相互作用。2、提取YTA、YTB、HL-2和9311黄化苗线粒体蛋白,western Blot分析发现,在YTA和HL-2黄化苗中ORF216有较高的的表达,YTB中没有。但是在不含orf216基因的9311中也检出了微弱的杂交信号。3、克隆OsRPLx和OsATP5x并诱导表达,然后分别与ORF216蛋白进行His pull-down实验并进行western Blot分析,结果证明OsRPLx与ORF216这两个蛋白可发生直接相互作用,而OsATP5x与ORF216两个蛋白之间没有直接相互作用。
【关键词】:水稻 细胞质雄性不育 ORF216 OsRPLx OsATP5x
【学位授予单位】:中南民族大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S511;Q946.1
【目录】:
  • 摘要7-8
  • Abstract8-9
  • 第一章 文献综述9-13
  • 1.1 植物细胞质雄性不育9
  • 1.2 植物细胞雄性不育基因及相关互作蛋白质的研究9-10
  • 1.3 蛋白质相互作用的研究方法10-12
  • 1.3.1 免疫共沉淀技术10
  • 1.3.2 酵母单(双)杂交技术10-11
  • 1.3.3 蛋白质Pull-down技术11-12
  • 1.4 本研究的目的及意义12-13
  • 第二章 ORF216蛋白与ORFH79蛋白的互作分析13-29
  • 2.1 实验材料、试剂及仪器13-16
  • 2.1.1 实验材料13-14
  • 2.1.2 实验试剂14-16
  • 2.2 实验方法16-24
  • 2.2.1 含有GST标签ORFH79原核表达载体构建16-20
  • 2.2.2 p GEX-6p1-orf H79融合蛋白的诱导表达20-23
  • 2.2.3 ORFH79的蛋白纯化。23
  • 2.2.4 ORF216与ORFH79的蛋白相互作用分析。23-24
  • 2.2.5 蛋白洗脱结果SDS-PAGE、银染及Western Blot分析24
  • 2.3 实验结果与分析24-28
  • 2.3.1 p GEX-6p1-orf H79原核表达载体构建24-25
  • 2.3.2 融合GST标签p GEX-6p1-orf H79蛋白诱导表达25-26
  • 2.3.3 ORF216与ORFH79蛋白pull-down实验26-28
  • 2.3.4 ORFH79蛋白纯化实验28
  • 2.4 讨论28-29
  • 第三章 ORF216蛋白与水稻线粒体蛋白的Western blot检测29-34
  • 3.1 实验材料、试剂及仪器29-30
  • 3.1.1 实验材料29
  • 3.1.2 实验试剂包括试剂、纯度及配制29-30
  • 3.2 实验方法30-31
  • 3.2.1 水稻不同品种线粒体的提取30-31
  • 3.2.2 不同水稻品种线粒体蛋白SDS-PAGE分析31
  • 3.2.3 不同水稻品种线粒体蛋白Western Blot分析31
  • 3.3 实验结果31-33
  • 3.3.1 水稻黄化苗的培养及线粒体的提取31-32
  • 3.3.2 线粒体蛋白的提取及western blot检测32-33
  • 3.4 讨论33-34
  • 第四章 ORF216与Os RPLx和Os ATP5x互作的分析34-49
  • 4.1 实验材料、试剂及仪器34-36
  • 4.1.1 实验材料34-35
  • 4.1.2 实验试剂35-36
  • 4.2 实验方法36-41
  • 4.2.1 水稻RNA的提取36-37
  • 4.2.2 含有GST标签Os RPLx及Os ATP5x原核表达载体构建37-40
  • 4.2.3 p GEX-4T1-Os RPLx和p GEX-6P1-Os ATP5x融合蛋白的诱导表达40
  • 4.2.4 ORF216与Os RPLx和Os ATP5x的蛋白相互作用分析。40
  • 4.2.5 互作蛋白洗脱结果SDS-PAGE、银染及Western Blot分析40-41
  • 4.3 实验结果与分析41-48
  • 4.3.1 水稻品种YTA叶片RNA的提取及检测41
  • 4.3.2 水稻Os RPLx基因和Os ATP5x基因原核表达载体的构建41-42
  • 4.3.3 融合GST标签Os RPLx蛋白和Os ATP5x蛋白诱导表达42-44
  • 4.3.4 ORF216与Os RPLx蛋白和Os ATP5x蛋白互作的验证44-48
  • 4.4 讨论48-49
  • 参考文献49-52
  • 致谢52

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