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《中南民族大学》 2015年
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重楼不同部位药用成分分析及SQS基因的原核表达分析

刘佳  
【摘要】:重楼是一味有止血、免疫调节等药理作用的传统中药。主要活性成分为甾体皂苷,根茎为主要药用部位,地上部分多被遗弃。根茎需3-5年才能入药,资源再生较慢,野生资源紧缺。重楼属在我国约有17种10变种,在选取优质品种推广种植的同时,开发新的重楼资源是缓解重楼药用资源紧缺的重要途径。本文利用HPLC法对4种重楼根、茎、叶、果实的多种甾体皂苷及皂苷元含量进行了定量的检测,通过对重楼根部与地上部分中药用成分含量的相关性分析,建立筛选重楼优质种质资源的新方法。同时通过对重楼种植废弃物茎、叶、果实的药用价值评估,开发新的药用资源。另外,随着近年来重楼在组培上技术上突破,利用生物工程技术对重楼资源进行开发具有了可行性。异戊二烯途径为甾体皂苷的生物合成途径,但其途径中关键酶的研究较少。本文从华重楼中克隆了关键酶鲨烯合酶(PpSQS)基因的cDNA序列,并进行了序列分析和原核表达,为利用次生代谢工程的方法,提高重楼品质,开发新的重楼资源提供前期研究基础。主要的研究结果如下:1)建立了有效的甾体皂苷及皂苷元的提取和HPLC检测方法。以薯蓣皂苷元,薯蓣皂苷,重楼皂苷I、II、VI、VII的含量为指标综合评价重楼的药用价值,4种重楼中药用价值最高的为七叶一枝花,其次为华重楼和球药隔重楼,最低的为狭叶重楼。总体来看重楼根中的甾体皂苷及皂苷元的含量较其他部位的高,但七叶一枝花果皮中的薯蓣皂苷元、重楼皂苷I,华重楼叶片中的薯蓣皂苷及皂苷元,以及球药隔重楼叶片中的重楼皂苷I的含量均较高,这些地上部分可作为新的药用资源开发的首选。四种重楼均含有重楼皂苷I,且在根中的含量与在茎、外种皮、果皮中的含量具有一定的相关性,这为利用地上部分药用成分含量评估地下根中药用价值提供可能。2)以新鲜组培苗华重楼叶片为材料,提取总RNA。根据已报道的滇重楼SQS基因(Genbank号:KC442294.1)设计特异性引物。采用PCR技术扩增出华重楼SQS基因,华重楼SQS的cDNA全长为1296 bp,含有1227 bp的ORF。经Blast比对,与滇重楼的相似度达到98%。验证了相同物种同一基因编码序列具有很高同源性。3)通过对二级结构预测反映出华重楼SQS具有较多的α-螺旋结构,该结构的氨基酸残基占64.55%,环状结构的氨基酸残基占到34.95%,几乎无β-折叠。与已测定结构的人类鳘烯合酶类似,通过构建三级模型发现华重楼鳘烯合酶与人类鳘烯合酶具有相似的活性中心,预示着华重楼可能与人的SQS基因具有相同的催化功能。并通过构建SQS基因的原核表达载体,在大肠杆菌E.coliBL21中表达,优化出华重楼SQS基因在E.coliBL21中最佳的表达条件。为利用次生代谢工程的方法,过表达华重楼药用成分合成途径中关键酶基因,提高重楼药用价值提供前期研究基础。
【关键词】:重楼 甾体皂苷 HPLC检测 鲨烯合酶基因 克隆 原核表达
【学位授予单位】:中南民族大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S567.239;Q943.2
【目录】:
  • 摘要8-9
  • ABSTRACT9-11
  • 第一章 前言11-19
  • 1 重楼属植物概况11-13
  • 1.1 重楼属植物的研究进展11
  • 1.2 重楼的药理作用11-12
  • 1.2.1 抗肿瘤作用11
  • 1.2.2 止血作用11-12
  • 1.2.3 免疫调节研究12
  • 1.2.4 镇静镇痛研究12
  • 1.2.5 心血管作用12
  • 1.2.6 其他作用12
  • 1.3 重楼属植株中含有的化学成分12-13
  • 2 重楼甾体皂苷的提取和HPLC检测13-15
  • 2.1 重楼中甾体皂苷合成的研究进展13-15
  • 2.2 重楼甾体皂苷与皂苷元的提取工艺15
  • 2.3 HPLC法在重楼甾体皂苷检测中的应用15
  • 3 重楼属植株关键酶基因的克隆与原核表达15-17
  • 3.1 重楼甾体皂苷合成途径中关键酶基因的研究进展15-17
  • 3.2 原核表达载体的构建及表达条件优化17
  • 4 本研究的目的、意义与思路17-19
  • 4.1 本实验的目的与意义17-18
  • 4.2 本实验的主要内容与思路18-19
  • 第二章 重楼根、茎、叶和果实中药用成分分析19-35
  • 1 引言19
  • 2 材料19-20
  • 2.1 材料与试剂19-20
  • 2.1.1 材料19
  • 2.1.2 试剂19-20
  • 2.2 主要仪器与设备20
  • 3 方法20-22
  • 3.1 甾体皂苷的提取与检测20-21
  • 3.1.1 不同提取甾体皂苷方法的比较20
  • 3.1.2 提取重楼中的甾体皂苷20
  • 3.1.3 色谱条件的优化20
  • 3.1.4 HPLC检测重楼甾体皂苷20
  • 3.1.5 标准品溶液的制备及线性关系考察20-21
  • 3.1.6 线性关系考察21
  • 3.1.7 色谱仪的精密度和稳定性分析21
  • 3.1.8 重复性和回收率实验21
  • 3.2 薯蓣皂苷元的提取与检测21-22
  • 3.2.1 供试品溶液的制备21
  • 3.2.2 色谱条件21
  • 3.2.3 标准品溶液的制备及线性关系考察21
  • 3.2.4 色谱仪的精密度和稳定性考察21
  • 3.2.5 重复性和回收率实验21-22
  • 4 结果与讨论22-34
  • 4.1 四种重楼不同部位重楼皂苷I、II、VI、VII含量的检测22-30
  • 4.1.1 甾体皂苷提取方法的选取22
  • 4.1.2 HPLC检测重楼中甾体皂苷色谱条件的优化22
  • 4.1.3 四种重楼皂苷标准品的HPLC检测及标准曲线的制备22-24
  • 4.1.4 色谱仪的精密度和稳定性分析24
  • 4.1.5 重复性和回收率实验24
  • 4.1.6 样品含量测定与分析24-30
  • 4.2 四种重楼不同部位薯蓣皂苷及皂苷元含量的检测30-34
  • 4.2.1 薯蓣皂苷标准品及标准曲线的制备30
  • 4.2.2 HPLC检测样品薯蓣皂苷的含量30-31
  • 4.2.3 薯蓣皂苷元标准品HPLC谱图和标准曲线的制备31
  • 4.2.4 精密度和稳定实验31
  • 4.2.5 重复性和回收率实验31-32
  • 4.2.6 HPLC检测样品薯蓣皂苷元的含量32-34
  • 5 结论34-35
  • 第三章 华重楼关键酶SQS基因的克隆与原核表达35-55
  • 1 引言35
  • 2 材料与试剂35-36
  • 2.1 材料35
  • 2.2 主要试剂35-36
  • 2.3 培养基36
  • 3 主要仪器设备36
  • 4 方法36-43
  • 4.1 华重楼SQS基因的克隆36-39
  • 4.1.1 华重楼种子快繁36
  • 4.1.2 华重楼叶片总RNA的提取及RNA浓度测定36
  • 4.1.3 制备第一链cDNA36-37
  • 4.1.4 华重楼SQS基因ORF框序列的PCR扩增37
  • 4.1.5 电泳及DNA片段回收37
  • 4.1.6 目的片段与克隆载体的连接37-38
  • 4.1.7 E.coli DH5α感受态细胞的制备38
  • 4.1.8 连接产物的转化38
  • 4.1.9 菌液PCR鉴定及测序38-39
  • 4.2 生物信息学分析39
  • 4.3 华重楼SQS基因的原核表达39-43
  • 4.3.1 碱变性法提取华重楼质粒DNA39-40
  • 4.3.2 原核表达载体构建40-41
  • 4.3.3 重组质粒在E.coliBl21中的表达41-43
  • 4.3.3.1 SDS-PAGE41-42
  • 4.3.3.2 表达条件的优化42-43
  • 5.结果与分析43-54
  • 5.1 华重楼总RNA的提取43
  • 5.2 华重楼SQS基因cDNA的克隆43-46
  • 5.3 华重楼SQS基因生物信息学分析46-50
  • 5.4 华重楼SQS基因的原核表达50-54
  • 5.4.1 碱变性法提取华重楼SQS基因质粒DNA50
  • 5.4.2 华重楼SQS基因原核表达载体构建50-52
  • 5.4.3 重组质粒在E.coli Bl21中的表达条件的优化52-54
  • 6 讨论54-55
  • 全文总结55-57
  • 参考文献57-62
  • 致谢62-63
  • 附录A:攻读硕士学位期间所发表的学术论文目录63

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