基于上转换荧光共振能量转移的糖类抗原15-3分析方法研究

【摘要】：乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一,是严重威胁女性健康的重大疾病,早期诊断是提升治愈率的重要途径。CA153是最常用的一种乳腺癌肿瘤标志物,其含量在乳腺癌发生后显著升高,对CA153进行精确诊断可为乳腺癌早期诊断提供可靠依据。荧光共振能量转移(FRET)是一项均相荧光检测技术,具有选择性好,检测灵敏,操作简便等特点,在生物医学领域受到了广泛关注。然而,目前基于FRET的体外诊断探针多采用可见光作为激发光源,由此产生较强的生物自发荧光,对检测结果带来显著的干扰。基于稀土离子发光的上转换荧光纳米颗粒(UCNPs)具有近红外激发、反Stokes发射的优点,可有效避免生物自发荧光的干扰,提高检测灵敏度。因此,本文采用UCNPs为能量供体,采用不同受体及模型构建了CA153上转换荧光纳米探针,同时实现了血清中CA153的分析检测。具体内容如下:1、以UCNPs和有机分子FAM分别为能量供体与能量受体,基于FRET机理及分子信标模型构建了CA153探针。首先通过溶剂热法合成了油酸包裹的UCNPs,采用酸处理去除表面配体,并通过聚丙烯酸(PAA)处理制得表面含有羧基的PAA-UCNPs。通过酰胺化反应将PAA-UCNPs与FAM修饰于发卡型DNA的两端,以缩短能量供体和能量受体之间的距离,触发FRET并猝灭UCNPs的上转换荧光。当体系中存在CA153时,可通过与适配体的特异性结合打开DNA发卡结构,使能量供受体距离增大,FRET作用减弱,体系荧光增强。根据荧光增强程度可实现CA153定量检测,其在缓冲溶液中的线性范围为0.01-150U/m L。探针具有较好的稳定性及选择性,能有效抵抗葡萄糖、甘氨酸、人血清白蛋白等常见生物组分的干扰,可用于人类血清中CA153的检测,其准确度与缓冲溶液中相当。2、前一个工作中构建了近红外光激发的CA153荧光探针,但其发射仍位于可见光区。为此,本论文第二个工作以Tm~(3+)-掺杂的UCNPs 809 nm左右上转换荧光为检测信号,以聚多巴胺纳米颗粒(PDA NPs)为能量受体,构建了近红外激发、近红外发射的CA153上转换荧光探针。将CA153适配体通过共价偶联于PAA-UCNPs表面,利用PDA NPs与适配体之间π-π堆积作用实现PDA NPs与UCNPs的组装。在FRET作用下,UCNPs位于809nm左右荧光被有效猝灭,同时PDA NPs 850nm左右荧光信号显著增强。当CA153存在时,其与适配体特异结合迫使UCNPs与PDA NPs分离,进而抑制FRET,引起UCNPs荧光增加以及PDA NPs的荧光减弱,进而实现CA153的高灵敏检测。该探针不仅适用于缓冲溶液中的CA153检测,还可成功应用于人类血清中CA153的定量分析,有望成为乳腺癌早期诊断的有力工具。