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《湖南大学》 2010年
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基于功能化纳米颗粒和仿生材料的生化分析新方法

张云  
【摘要】:利用免疫分析技术对复杂基质中的目标分析物进行高灵敏度和高选择性的检测,是现代生物化学和生物医学研究领域中极具吸引力的热点课题之一。特别是,在临床医学免疫诊断中,检测病人样品中的痕量疾病标志物对实现相关疾病的早期诊断、早期治疗以及病因的探索具有极为重要的意义。目前免疫分析方法已有许多报道,但这些方法大多存在操作复杂耗时、通量低、仪器昂贵、试剂和样品耗费量大、对操作人员要求较高的专业技能等诸多问题。因此,开发一些快速、高通量、低成本且易于临床推广和现场应用的免疫分析新方法是一件很有价值的工作。此外,由于电化学酶生物传感器具有灵敏度高、制造简单、价格低廉等诸多特点,它们在生化分析中的应用受到了人们越来越多的关注。但是,酶生物分子固定化技术一直是制约这类微型分析装置快速发展与广泛应用的“瓶颈”。针对当前免疫分析方法和酶生物分子固定化平台构建中存在的焦点和难点问题,本论文创新性地应用荷叶和贻贝仿生膜,并结合使用功能化生物纳米颗粒,发展了一系列单/多组分免疫检测新方法以及基于新型生物分子固定化平台设计的电化学酶生物传感器,实现了对目标物的高灵敏测定。主要内容如下: (1)探寻有效的途径用于降低昂贵的试剂和珍贵的生物样品的用量,将有助于降低具有诸多优点的悬浮免疫分析的检测成本,使其更易于推广应用。在第2章中,首次将荷叶仿生超疏水表面引入悬浮免疫分析平台的设计。以聚碳酸酯为模型聚合物,通过选择合适的溶剂和非溶剂,提出了一种基于非溶剂诱导相分离的超疏水表面制备新方法。结果表明,新方法可于室温下在多种材料基底表面上快速制备同时具有高的水的接触角(约为160°)和低的水的滑动角(小于5°)的超疏水聚碳酸酯膜。该膜还具有良好的抗腐蚀性能和机械稳定性。随后,在普通检测试管(即10 mL离心管)内壁表面上修饰聚碳酸酯膜,首次制备了一种基于超疏水表面的悬浮免疫分析平台(superhydrophobic surface-based suspension immunoassay platform, SSBSIP)。进而利用该新平台,以人免疫球蛋白G(IgG)为模型分析物,发展了一种基于金增强纳米金标记信号放大的磁悬浮比色免疫分析新方法。研究结果表明,SSBSIP在轻微机械振荡条件下即可实现悬浊反应溶液(如免疫磁探针与样品)的最大限度的均匀混合,形成具有较高抗原-抗体结合效率和较快免疫反应动力学的“循环流动反应体系”。基于SSBSIP的新方法仅需较小的试剂和样品用量(如单步免疫反应中仅需10μL),可实现对人IgG的快速(如单步免疫反应仅需20 min)、高灵敏的比色检测,检测下限约为25 ng/mL。此外,SSBSIP还具有自清洁能力,可反复使用。 (2)日本血吸虫病是一种古老的地方性传染疾病,严重威胁着广大疫区人民的身体健康,成为世界上亟待解决的一个严重公共卫生问题。在第3章中,应用开发的SSBSIP新平台,结合铜增强纳米金标记信号放大策略,成功发展了一种磁电化学金属免疫分析新方法,用于定量检测感染兔血清中的日本血吸虫抗体。研究结果表明,通过协同使用牛血清白蛋白-正常兔血清双重封闭试剂和免疫磁分离以将非特异性吸附影响降至最低,本方法可实现对浓度范围在2 ng/mL ~ 15μg/mL的血吸虫抗体的特异检测,检测下限约为1.3 ng/mL。与最近报道的其他血吸虫抗体检测方法相比,新方法在试剂和样品用量、单步免疫反应时间、检测下限等方面具有显著优势。用于实际样本分析时,该方法不仅能很好地鉴定血吸虫感染血清的感染程度,而且可获得与经典的酶联免疫吸附法(ELISA)基本一致的结果,表明其可望用于日本血吸虫病的临床生化诊断。 (3)多组分免疫分析法,由于具有分析通量高、试剂和样品消耗少、分析成本低等突出优点,近年来成为免疫分析研究中的热点之一。在第4章中,采用电化学沉积手段将廉价的铅笔石墨上的石墨颗粒修饰上具有微米结构的金层,制备了由金修饰石墨颗粒构成的微电极阵列,进而将其应用于基于电化学阻抗图谱的多组分免疫分析新方法研究。在单分析物实验中,通过结合基于纳米金的信号放大策略,使用该微电极阵列的阻抗免疫传感器可实现对浓度范围在0.05 ~ 100 ng/mL的人IgG模型分析物的高灵敏检测,检测下限约为36 pg/mL。与使用普通金电极的情况相比,该传感器的检测灵敏度约高出三个数量级。此外,所引入的电位控制单分子层功能膜组装(脱附)技术,可有效减少传感器制备时间,并实现传感界面的快速再生。多组分实验证明,同时使用多个微电极阵列平台可实现一个样品溶液中多种蛋白质的近同时电化学阻抗检测。 (4)基于硝酸纤维素膜的免疫金(-金或银)染色法具有诸多优点,特别适于低收入地区和发展中国家中的传染病筛查以及蛋白质等生化物质的即时检测和现场分析。但绝大多数的现有方法普遍存在一些问题,包括极低的硝酸纤维素膜利用率、不宜进行多组分同时分析和难以有效抑制“咖啡环效应”(导致所得环状印迹不利于进行后续的准确定量分析)等。在第5章中,为了从根本上解决上述问题,实验通过将硝酸纤维素膜阵列组装于超疏水聚碳酸酯功能表面,开发了一种水溶液扩散局域化平台(aqueous solution diffusion-localized platform, ASDLP),并将之用于发展基于免疫金-金染色的高灵敏的多组分同时比色检测新方法。研究结果显示,由于聚碳酸酯膜具有优异的“排斥水(溶液)”的性质,试剂和样品溶液的扩散被局限于亲水硝酸纤维素膜表面,因而从根本上赋予了基于ASDLP的免疫金-金染色法各种优点,包括硝酸纤维素膜具有100%的利用率、可用于多组分的同时比色检测、可通过有效地抑制“咖啡环效应”获得具有均匀形貌的印迹结果以利于后续的准确定量分析、非检测区域(即白色的聚碳酸酯膜)表现出较低的背景颜色信号、以及ASDLP可反复使用等。 (5)在电化学酶生物传感器的制备中,关键步骤之一就是采用合适的固定化技术把大量的酶生物分子稳定地固定到换能器表面,并使其能保持良好的生物活性。在第6章中,合成了具有微/纳阶层结构的花簇状氧化锌颗粒,进而结合使用壳聚糖和纳米金以构建辣根过氧化物酶的固定化平台,发展了一种新的无电子媒介体H2O2生物传感器。花簇状氧化锌颗粒可为辣根过氧化物酶的固定提供较大的表面积。壳聚糖和带正电的氧化锌颗粒,可分别通过物理包埋作用和静电吸附,将大量的标记了辣根过氧化物酶的负电性的纳米金组装到电极表面。此外,具有优异生物相容性和导电性的纳米金不仅可以提高辣根过氧化物酶的负载量,而且可以很好地保持辣根过氧化物酶的生物活性,并有效促进酶与电极之间的电子传递。研究结果表明,通过氧化锌颗粒和纳米金的协同作用,发展的酶传感器实现了对H2O2的快速、灵敏的直接电化学检测,线性检测范围是1.5μM ~ 45 mM,检测下限约为0.7μM。 (6)基于聚合物包埋的酶生物分子固定技术具有许多优点,但目前广泛使用的各种聚合物材料(如壳聚糖)通常与基底电极的结合力较弱,容易导致固定的酶生物分子在洗涤和检测过程中泄露。在第7章中,首次以贻贝仿生的高粘性聚多巴胺膜为功能基底膜并协同使用纳米金,构建了一种具有高稳健性能的酶生物分子固定化新平台。进而以固定辣根过氧化物酶为例,发展了一种新的电化学酶传感器用于H2O2的测定。结果表明,借助高生物亲和性的聚多巴胺膜对基底电极的高粘附力以及纳米金的“电子通道”作用,不仅可以实现对酶分子在电极表面的高活性、高稳定性的固定化,而且能促进酶活性中心和电极表面间的电子传递。与使用壳聚糖/纳米金的酶传感器比较,所发展的聚多巴胺膜/纳米金酶传感器具有明显增强的H2O2检测性能,线性检测范围为0.4μM ~ 45 mM,检测下限约为0.37μM。此外,该H2O2传感器具有优良的检测与存贮稳定性以及较好的抗干扰能力。
【学位授予单位】:湖南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:TB383.1;TB391

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【参考文献】
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