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《湖南大学》 2009年
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基于新型两亲与纳米材料的毛细管电泳分析

刘倩  
【摘要】:毛细管电泳(CE)是一种强大的分离分析工具,曾在人类基因组学中发挥过重大作用。虽然目前CE的应用领域越来越广,基于CE的芯片技术也是发展得如火如荼,但是CE自身方法学方面的研究步伐却有放缓的趋势。一些瓶颈问题(如蛋白质分析中的管壁吸附问题)目前仍没有很好的解决办法,这严重制约了CE的发展与应用。另一方面,材料科学在近二十年突飞猛进的发展为各行各业带来了巨大的变革。新材料带来新性能的同时也为分析科学带来了解决问题的新工具。本论文工作旨在立足于毛细管电泳与材料科学的交叉领域,利用新型材料(主要包括两亲和纳米材料)提供的优异性质,为CE中的一些瓶颈问题(如蛋白质吸附抑制、电渗控制等)提供新的解决方案。围绕着这个目的,本论文主要开展了以下工作: (1)首次使用了一种新型表面活性剂——双子表面活性剂(Gemini)作为毛细管动态涂层来控制电渗(EOF)和抑制碱性蛋白质的管壁吸附。这类新型表面活性剂具有独特的分子结构,一个分子中包含两条疏水的烷基链和两个亲水基团,这赋予了它很多优于传统表面活性剂的性质,如更低的CMC、更好的表面活性、更好的水溶性等。我们发现这种新型的Gemini表面活性剂具有比传统单链表面活性剂更强的EOF控制能力,而且在较宽的pH范围内(pH 3 ~ 6)都能得到高效、快速的蛋白质分离(分离效率N 300 000 plates/m)。该动态涂层还可以适用于复杂生物样品分析。这个工作初步揭示了Gemini表面活性剂这类新型两亲材料在CE中的应用潜力。 (2)Gemini动态涂层虽然简单易用,但是动态涂层需要在电泳缓冲液中添加表面活性剂,这可能会对分离和检测造成影响。因此,我们在上一个工作的基础上,合成了疏水链更长的Gemini表面活性剂,使动态涂层转变为半永久涂层,从而可以避免动态涂层添加剂对分离和检测造成的干扰。得到的Gemini半永久涂层具有良好的稳定性,且碱性蛋白质的分离效率比动态涂层更高(N 500 000 plates/m)。该半永久涂层的制备方法非常简单,只需用Gemini溶液冲洗毛细管即可。而且,我们发现Gemini的联接基的长度可以作为调节EOF和分析物淌度的工具,这也提供了一种新的不依赖于缓冲组成的EOF调控方法。 (3)虽然半永久涂层在抑制蛋白质管壁吸附方面非常有效,但是涂层的稳定性还有待进一步强化。因此,我们接下去开发了一种简便、通用的方法来增强Gemini半永久涂层的稳定性。这种方法是通过往阳离子表面活性剂涂层中添加少量带相反电荷的阴离子表面活性剂SDS来实现的。SDS能够非常显著地改变阳离子表面活性剂的堆积参数,从而可以调节涂层的结构和稳定性。在最优的SDS浓度时,可以得到非常牢固的半永久毛细管涂层。在稳定性增强的同时,这种阴/阳离子混合表面活性剂涂层同样可以非常有效地抑制碱性蛋白质的管壁吸附。这种方法简便易操作,而且适用于所有阳离子表面活性剂涂层。 (4)在上面分离碱性蛋白质的工作的基础上,我们进一步开发了可用于同时分离酸性和碱性蛋白质的分析方法。我们发现使用长链Gemini表面活性剂作为缓冲添加剂,可以有效地同时抑制酸性和碱性蛋白质在毛细管壁的吸附,而且表面活性剂的用量(0.1 mM)大大低于传统表面活性剂。有趣的是,改变Gemini的联接基的长度能够对蛋白质的电泳淌度进行一定的调节,从而对分离的选择性进行优化。该分析方法可适用于复杂的生物样品分析。 (5)在蛋白质分析的基础上,我们进一步将Gemini涂层的应用对象扩展到了无机离子。CE中的无机阴离子分离一直是一个难题。我们使用Gemini半永久涂层在水-有机混合溶剂中进行了无机阴离子的分离。Gemini半永久涂层在40% v/v有机溶剂存在的情况也能保持很好的稳定性,这极大地扩展了这类新型涂层材料的应用领域和环境。更重要的是,我们发现改变Gemini联接基长度可以调节和优化阴离子的分离度。这种优化方法与使用有机溶剂相比,优点在于它不会导致EOF下降和分离时间的延长。上面这些工作构建了一套完整的基于Gemini表面活性剂的CE分析体系,包括了用于动态涂层、半永久涂层和缓冲添加剂,包括了不同的分析对象,也包括了水相和非水相的应用环境。 (6)在蛋白质分析的基础上,我们进一步开发可用于复杂蛋白组样品分析的阳离子胶束CE方法,这也是首次报道基于阳离子表面活性剂的CE方法在实际样品中的应用。为了论证方法的普适性,我们使用了普通的阳离子表面活性剂CTAB作为缓冲添加剂,成功地进行了复杂生物样品如血浆和血红细胞样品的分析,以及蛋白酶解产物和细胞的全蛋白粗提物的分析。结果证明阳离子胶束CE具有简单、高效、重现性好等优点,是一种非常有前景的蛋白质分析方法,并有望在将来的蛋白组学研究中发挥作用。 (7)在以上工作的基础上,我们进一步将新型纳米材料与Gemini表面活性剂结合起来,用于CE蛋白质分析和生物样品分析。我们首先报道了一种新的金纳米粒子合成方法,使用Gemini作为纳米金合成的保护试剂,调节Gemini的联接基长度可以实现对纳米金粒径及粒径分布的控制。然后我们将合成的这种纳米材料作为CE的缓冲添加剂用来同时分离酸性和碱性蛋白质,结果表明纳米粒子的加入可以进一步提高蛋白质分离效率。这种Gemini保护的金纳米粒子结合了Gemini和纳米金二者在CE中的优点,因此成为一种很好的分离材料。 (8)我们接下去考察了另一类新型两亲材料——氨基酸离子液体在CE中的应用。我们首次将氨基酸离子液体用于CE手性分离中的手性配体,发现这类新型配体可以提供比传统的氨基酸配体更高的手性选择性。我们还进行了HPLC实验与CE实验进行对比,基于对比的结果对分离机理进行了详细的探讨。该工作表明氨基酸离子液体是一类优秀的手性配体,并揭示了这类新型离子液体在手性分离上的巨大的应用潜力。 (9)在上面的使用新型材料来开发CE新分析方法的同时,我们也在思考是否能够使用CE来作为材料学中的一种表征手段,反过来促进材料科学的发展。因此,在本论文最后的工作中,我们尝试了将CE用于监测纳米材料和聚电解质的层层组装。阳离子聚电解质和金纳米粒子在毛细管壁的层层组装导致毛细管壁的表面电荷发生改变,产生同步的EOF变化,因此EOF可以作为监测组装过程中的探针。通过监测EOF变化,我们可以得到组装的动力学参数,并且可以对组装过程进行详细的优化。这个工作提供了一种新工具——毛细管电泳——用于多层膜的研究,同时也扩展了CE在材料学方面的应用,展示了CE在分析分离以外的领域的巨大应用潜力。 总之,本论文致力于将新型两亲和纳米材料应用于毛细管电泳分析,来解决CE分析中的一些瓶颈问题和开发新的分析方法。这些新材料的利用为CE的发展打开一扇新的窗口,赋予了CE新的生命力。我们相信材料科学尤其是纳米材料科学的发展必将为毛细管电泳的发展带来新的生机和活力。
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