生物传感与实时荧光定量技术检测堆肥微生物酶编码基因的研究
【摘要】：随着社会发展,农业废物的无害化、减量化和资源化处理,越来越受到人们的重视。通过合理的堆肥可以实现这一目标。木质素、纤维素是农业废物堆肥化过程中的主要限速有机物,其降解被认为是快速堆肥的关键。黄孢原毛平革菌在降解木质素方面有着重要意义,本研究以黄孢原毛平革菌的基因组DNA为模板,根据木素过氧化物酶的基因序列设计引物,比较了此菌基因组DNA的提取方法,并通过聚合酶链式反应和酶切反应得到339bp及265bp的待测特异性DNA片段,制作DNA传感器以检测所得DNA片段。利用自组装单分子膜法,将巯基修饰的探针固定在金电极表面,并研究了夹心式和竞争式两种杂交机制,采用辣根过氧化物酶作为标记物。在电化学分析中采用了循环伏安法、交流阻抗法、方波伏安法、微分脉冲伏安法等一系列电化学分析方法。研究表明:SDS-CTAB法提取黄孢原毛平革菌基因组DNA效果较好。电化学分析中,电流响应值与DNA检测浓度成线性关系。夹心式杂交机制中,线性回归方程为y=8×1010x+0.280,线性相关系数为0.981,回收率为97.93%～113.53%。竞争式杂交机制中,作出生物传感器检测黄孢原毛平革菌DNA低浓度段曲线,回归方程为y=-4×1010x+0.366,线性相关系数为0.993。其中y为电流跃迁值(μA);x为DNA检测链浓度(mol/mL)。此外,对传感器进行再生,实验结果表明再生性能较好。
纤维素的降解是堆肥中很重要的一个过程,产纤维素酶能力最强的常用的微生物是木霉属的里氏木霉。本研究采用DNA生物传感技术以及实时荧光定量PCR技术对其能产生纤维二糖水解酶的编码基因进行检测,达到检测堆肥进程的目的。DNA初始浓度的对数值与循环阈值成良好的线性关系,回归方程为y=-2.7563x+38.284,r2=0.9903,达到了较好的效果。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S141.4
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