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基于生物调控的Au纳米颗粒合成及其细胞生物学效应研究

张晓蓉  
【摘要】:纳米材料具有独特的物理和化学性质,如大的比表面积、高的催化活性和生物相容性,已被广泛地用于催化、能源、生物和分析等领域。随着传统的物理和化学制备纳米材料方法的发展,近年来采用生物方法制备和组装纳米结构材料的研究引起了广泛的关注。生物合成的纳米材料因富集大量生物活性分子被赋予独特的物理化学特性、生物活性以及良好的分散性和稳定性,使其在生物化学等领域具有广泛的应用前景。目前,已有多种生物包括细菌、放线菌、真菌以及一些高等植物用于合成金、银、硫化镉、硫化锌以及磁性氧化铁等纳米材料。与此同时,实现纳米材料尺寸、形貌生物可控合成也成为纳米生物合成新技术前沿研究领域之一。在本研究小组已有的纳米生物技术研究工作基础上,本论文瞄准这一前沿研究方向,开展了纳米材料生物可控合成技术的研究。以4株真菌包括青霉(Penicillium sp.)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulan)、镰刀菌(Fusarium sp.)及尖孢镰刀霉(Fusarium oxysporum)和尖叶拟船藓植物(Dolichomitriopsis diversiformis)为生物材料,研究了不同真菌合成Au纳米颗粒的生化合成机制;发展了细胞内调控合成不同尺寸Au纳米颗粒新方法;探索了D. diversiformis植物细胞外调控合成不同形貌Au纳米材料的规律;并进一步考察了富集不同生物活性分子Au纳米颗粒的细胞生物学效应,以及对肿瘤细胞毒性作用机制。以期为生物调控合成纳米材料基础性研究和进一步应用提供有益的探索。本论文研究工作具体包括以下几方面: 1.不同真菌合成Au纳米颗粒生化合成机制研究 利用环境分离的A.pullulans、Fusarium sp.及F. oxysporum3株真菌发展了真菌细胞内合成Au纳米材料的生物方法,并对其合成的生化合成机制进行了比较分析。将A. pullulans、Fusarium sp和F. oxysporum细胞与氯金酸共孵育,3株真菌均可细胞内合成Au纳米颗粒;生化成分分析及FTIR光谱表征发现,A.pullulans细胞以还原糖为生物活性分子介导细胞内Au纳米颗粒合成,而Fusariumsp.及F. oxysporum以蛋白质为生物活性分子介导细胞内Au纳米颗粒组装;进一步SDS-PAGE蛋白质电泳分析表明,Fusarium sp细胞内分子量为100kDa,25kDa和19kDa的蛋白质参与Au纳米颗粒合成,而F. oxysporum细胞内分子量为25kDa和19kDa蛋白质参与Au纳米颗粒合成,A. pullulans合成的Au纳米颗粒不存在蛋白质。研究结果将揭示3株真菌细胞不同的生物活性分子介导了Au纳米材料的合成。通过采用LC-MS/MS法对蛋白质分子进行鉴定,结果表明Fusariumsp.参与合成的Au纳米颗粒的3个蛋白质分别为脂膜ATP酶(plasma membraneATPase)、3-葡聚糖结合蛋白(3-glucan binding protein)及3-磷酸甘油脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase),这些蛋白均为细胞能量代谢相关蛋白。细胞超薄切片表征发现,细胞内合成的Au纳米颗粒均存在真菌细胞液泡中。时间动力学TEM结果表明,还原糖易于合成球形、单分散性Au纳米颗粒,蛋白质易于介导Au纳米颗粒聚合体的组装。 2.基于温度调控真菌细胞内合成不同尺寸Au纳米颗粒研究 以温度为调控因子,利用环境分离的真菌Penicillium sp发展了一种细胞内调控合成尺寸可控的Au纳米颗粒新方法。将真菌Penicillium sp细胞与氯金酸共培育后,可在细胞内合成球形的、单分散性的Au纳米颗粒,粒径分布18-35nm。合成动力学TEM表征发现,细胞吸收反应溶液AuCl4-,在细胞内首先被还原形成Au核,再组装成Au纳米颗粒。生物组分分析结果表明,Penicillium sp细胞内还原糖为活性组分介导细胞内Au纳米颗粒的合成。通过控制合成反应温度,在4℃条件下,Penicillium sp细胞可细胞内合成4-10nm粒径的Au纳米颗粒。在28℃则合成20-37nm粒径颗粒,在不恒定的温度条件下,Penicillium sp细胞则合成多分散性的Au纳米颗粒。TEM结果表明,纯化的Au纳米颗粒也表现为球形、单分散性等相似的特征。FTIR光谱表征表明,纯化的Au纳米颗粒存在1405cm-1多糖羰基伸缩振动。研究结果揭示通过控制反应温度条件,可实现真菌细胞内对纳米颗粒的尺寸控制。 3.基于pH调控植物细胞外合成不同形貌Au纳米颗粒研究 利用尖叶拟船藓(D. diversiformis)植物体为生物材料,以pH为调控因子,发展了一种细胞外生物调控合成Au纳米颗粒的新方法。将氯金酸钠与过夜浸泡于不同pH溶液的藓植物体混合液共孵育后,在pH3-6条件下,藓植物体可合成球形、三角形、立方体等形貌的Au纳米颗粒。生物组分分析发现,藓植物蛋白质为活性分子介导Au纳米颗粒合成。1(?)AGE分析表明,该蛋白质分子量为71kDa、等电点pI4.9。圆二色谱(Circular Dichroism, CD)表征发现,在不同的pH溶液中该蛋白质的二级构象可以被诱导而改变。在pH3溶液中其二级结构为无规则卷曲;pH4溶液中其二级结构为中间过渡类型;pH5溶液中其二级结构为α螺旋;而在pH6条件下其二级结构为无规则卷曲,并伴随三级的改变。进一步的重组装实验结果揭示,该藓植物蛋白在Au纳米颗粒合成过程起着模板作用,并控制不同形貌Au纳米颗粒的组装。在pH3溶液中具有无规则卷曲二级结构的蛋白质,可组装三角形和球形两种形貌Au纳米颗粒,多分散性特征。pH4溶液中具有中间过渡类型二级结构的藓蛋白质,可组装球形Au纳米颗粒,单分散性好。pH5溶液中具有α螺旋二级结构的藓蛋白质,可组装立方体形形貌的Au纳米颗粒。在pH6条件下具有无规则卷曲二级结构,并伴随三级改变的蛋白质,组装的Au纳米颗粒为多分散性的球形。研究结果揭示通过控制合成pH条件,可实现以蛋白质为活性分子的生物调控合成不同形貌纳米颗粒。 4.不同真菌合成的Au纳米颗粒细胞生物学效应研究 利用Penicillium sp.、Fusarium sp和F. oxysporum真菌调控合成了不同生物分子组成的球形Au纳米颗粒,研究了3种Au纳米颗粒引起的肝癌细胞株BEL7404细胞生物学形态变化,细胞粘附性改变,以及对细胞活性影响等一系列细胞生物学效应。实验结果揭示,不同生物分子组成纳米颗粒引起的细胞生物学效应差异很大。Penicillium sp细胞合成具有还原糖组成的Au纳米颗粒对供试细胞BEL7404有较强的毒性,ICso为51μg。而Fusarium sp和F. oxysporum细胞合成的具有蛋白质组成的Au纳米颗粒对供试细胞BEL7404无毒性,具有较好的生物相容性。可见,利用生物合成不同生化组成的Au纳米颗粒有望发展为纳米载体或者潜在纳米药物应用于生物医学等领域。 5.基于藓植物合成的蛋白质Au纳米颗粒细胞毒性机制研究 利用植物尖叶拟船藓(D. diversiformis)合成了具有蛋白质组成的球形Au纳米颗粒,研究了蛋白质Au纳米颗粒与肝癌细胞株BEL7404及肝正常细胞株L-02孵育后引起的细胞生物学效应和细胞毒性及机制。实验结果发现,藓合成具有蛋白质组成的Au纳米颗粒对细胞的毒性作用具有一定的选择性,对肝癌细胞株BEL7404具有较强的毒性作用,且具有浓度依赖性。但对肝正常细胞株L-02毒性较小于肝癌细胞株。进一步将蛋白质Au纳米颗粒与MCF-7及Hela等肿瘤细胞共孵育,结果发现该颗粒对这2种肿瘤细胞均较强的毒性作用。利用流式细胞术分析该纳米颗粒的选择性作用机制表明,蛋白质Au纳米颗粒对细胞毒性作用源于藓蛋白质,当蛋白质Au纳米颗粒的蛋白质解离后,其Au溶液对细胞没有毒性。该实验结果将为藓植物合成的蛋白质纳米颗粒发展为用于肿瘤治疗的纳米组合药物提供实验参考。


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